《细胞凋亡与肿瘤》课件.ppt
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- 细胞凋亡与肿瘤 细胞 肿瘤 课件
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1、细胞凋亡与肿瘤 第第 八八 章章 长海医院病理科长海医院病理科 何妙侠何妙侠 学 习 要 求 1 1 掌握细胞凋亡的概念及与坏死的区别掌握细胞凋亡的概念及与坏死的区别 2 2 掌握细胞凋亡的基因调控机制及其与肿瘤掌握细胞凋亡的基因调控机制及其与肿瘤 发生的关系发生的关系 3 3 了解细胞凋亡的常用检测方法及其特点了解细胞凋亡的常用检测方法及其特点 前 言对细胞死亡的认 识Nature Reviews,Molecular cell biology.2001;2:5452001;2:545P C D Apoptosis18581858年,年,VirchowVirchow开始研究细胞死亡开始研究细胞
2、死亡19511951年年,Glucksman,Glucksman提出程序化细胞死亡提出程序化细胞死亡 (Programmed Cell Death,PCD)(Programmed Cell Death,PCD)19721972年年,Kerr,Kerr提出细胞凋亡提出细胞凋亡 (Cell ApoptosisCell Apoptosis)Sydney Brenner H.Robert Horvitz John E.Sulston20022002年英国人悉尼年英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯布雷诺尔、美国人罗伯特特霍维茨和英国人约翰霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿,苏尔斯顿,因在因在细胞凋亡细胞凋亡研究工作
3、中取得的杰出成就研究工作中取得的杰出成就 获诺贝尔生理与医学奖获诺贝尔生理与医学奖主 讲 内 容细胞凋亡特点细胞凋亡检测发生调控机制细胞凋亡与肿瘤主 讲 内 容细胞凋亡检测发生调控机制细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡特点细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡是机体生长发育、细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程胞自主性死亡的过程(dropping off,falling off)细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡是高度有序的基因细胞凋亡是高度有序的基因
4、控制的一系列活性酶参与的控制的一系列活性酶参与的过程,是多细胞动物生命现过程,是多细胞动物生命现象的重要属性象的重要属性细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡与胚胎发生发展、个细胞凋亡与胚胎发生发展、个体形成、器官的细胞平衡稳定体形成、器官的细胞平衡稳定等有密切的关系等有密切的关系蝌蚪尾蝌蚪尾消失消失发育过程发育过程手足成形过程手足成形过程脊椎动物脊椎动物神经系统发育神经系统发育细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别近年来研究表明,肿瘤的发生近年来研究表明,肿瘤的发生与细胞凋亡的异常密切相关;与细胞凋亡的异常密切相关;细胞凋亡受抑作为细胞增殖紊细胞凋亡受
5、抑作为细胞增殖紊乱的对应面在肿瘤发生发展和乱的对应面在肿瘤发生发展和转归方面均有重要作用转归方面均有重要作用。细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别该该“死死”的细胞不死,如自身的细胞不死,如自身免疫性疾病,恶性肿瘤等免疫性疾病,恶性肿瘤等不该死的细胞死了,可能与老不该死的细胞死了,可能与老年性痴呆、帕金森症等有关年性痴呆、帕金森症等有关细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡与衰老密切相关细胞凋亡与衰老密切相关细胞凋亡对维持机体的遗传细胞凋亡对维持机体的遗传稳定性起着重要的作用稳定性起着重要的作用老 化细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区
6、别程序性死亡程序性死亡是功能上的概念,是功能上的概念,而而细胞凋亡细胞凋亡是形态学上的概是形态学上的概念,不是所有的程序性死亡念,不是所有的程序性死亡都表现为凋亡,即不一定存都表现为凋亡,即不一定存在凋亡的形态学改变在凋亡的形态学改变细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别凋亡细胞形成多个大小不等凋亡细胞形成多个大小不等有膜包裹的有膜包裹的 凋亡小体凋亡小体(apoptotic bodies)内含形内含形态保存完好的细胞器和态保存完好的细胞器和/或浓或浓缩的细胞核碎片,后期被吞缩的细胞核碎片,后期被吞噬细胞清除噬细胞清除细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别1 受
7、基因调控,死亡过程受基因调控,死亡过程具有程序性,需要某些基因具有程序性,需要某些基因的启动并合成新的的启动并合成新的RNA和和蛋白质蛋白质细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别2 形态学上表现为细胞皱形态学上表现为细胞皱缩、染色质沿核膜聚集、胞缩、染色质沿核膜聚集、胞体胞核裂解包裹形成凋亡小体胞核裂解包裹形成凋亡小体体细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别3 常单个存在于组织中常单个存在于组织中4 周围组织无炎症反应周围组织无炎症反应细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别5 DNA片段化:琼脂凝胶片段化:琼脂凝胶电泳可见特殊的阶梯状由电泳可见特
8、殊的阶梯状由不同倍数的不同倍数的l80200bp核核苷酸组成苷酸组成DNA梯带图梯带图 6 合成一些大分子物质合成一些大分子物质细胞凋亡特点 概念意义 形态变化 基本特征 与坏死区别细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别 特特 点点 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死发生原因发生原因形态特征形态特征 受累范围受累范围 细胞膜细胞膜 细胞体积细胞体积 染色质染色质 细胞核细胞核 细胞器细胞器 凋亡小体凋亡小体 周围组织周围组织生化特征生化特征 调控调控 DNADNA降解降解 蛋白质合成蛋白质合成 对对ATPATP要求要求生理性或病理性生理性或病理性多为单个或散在细胞多为单个或散在细胞仍
9、保持完整仍保持完整固缩变小固缩变小聚集在核膜下,呈半月形聚集在核膜下,呈半月形先固缩后降解先固缩后降解仍保持完整仍保持完整有,被临近细胞或巨噬细胞吞噬有,被临近细胞或巨噬细胞吞噬无炎症反应无炎症反应整个过程受基因调控主动进行整个过程受基因调控主动进行有规则,电泳呈梯状有规则,电泳呈梯状DNADNA谱带谱带有有必需必需病理性病理性多为连续大片组织细胞多为连续大片组织细胞完整性破坏完整性破坏肿胀增大肿胀增大分散凝集,呈絮状分散凝集,呈絮状溶解溶解肿胀,内质网明显崩解肿胀,内质网明显崩解无,后期细胞破裂溶解,无,后期细胞破裂溶解,残屑被巨噬细胞吞噬残屑被巨噬细胞吞噬有炎症反应有炎症反应整个过程均被动
10、进行整个过程均被动进行无规则,电泳多呈弥散状无规则,电泳多呈弥散状无无无需无需主 讲 内 容细胞凋亡特点凋亡调控机制细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测1 光学显微镜观察光学显微镜观察 优点:光镜优点:光镜技术简单、快速,能短时间内技术简单、快速,能短时间内 进行大样本分析进行大样本分析 缺点:样本制备复杂、耗时缺点:样本制备复杂、耗时 形态计数常受到主观因素干扰形态计数常受到主观因素干扰 重复性差重复性差 细胞形态学的检测2 电子显微镜观察电子显微
11、镜观察 优点:优点:可显示凋亡细胞的许多形态学特点可显示凋亡细胞的许多形态学特点 尤其是膜结构和细胞器的变化尤其是膜结构和细胞器的变化 主要用于获取细胞凋亡的定性资料主要用于获取细胞凋亡的定性资料 缺点:样本制备复杂、耗时缺点:样本制备复杂、耗时细胞形态学的检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测1 台盼兰(台盼兰(Trypan blue)染色法)染色法 台盼兰为细胞膜非通透性活性染料,坏死台盼兰为细胞膜非通透性活性染料,坏死细胞着色,而活细胞与早期凋亡细胞不着色细胞着色,而活细胞与早期凋亡细胞不着色意义:意义:方法简单、便捷;方法简单、便捷;常常用于
12、细胞死亡的初步评估常常用于细胞死亡的初步评估细胞膜完整性的检测2 丫啶橙(丫啶橙(acridine orange,AO)和溴化乙啶)和溴化乙啶(ethidium bromide,EB)双染法)双染法 AO和和EB都能结合都能结合DNA的荧光染料,可的荧光染料,可 分别产生兰色和橙色荧光,其中分别产生兰色和橙色荧光,其中 AO能透过能透过 完整的细胞膜,而完整的细胞膜,而 EB 则只能染色胞膜受损则只能染色胞膜受损 的细胞的细胞细胞膜完整性的检测AO/EBAO/EB双染法意义双染法意义 可用于荧光显微镜或流式细胞仪可用于荧光显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死细区分活细胞或早期凋亡细
13、胞和坏死细胞或继发性坏死细胞胞或继发性坏死细胞 较台盼兰染色精确、详细较台盼兰染色精确、详细细胞膜完整性的检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测琼脂糖电泳法琼脂糖电泳法 琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖凝胶电泳中 细胞凋亡呈现具有特征性的细胞凋亡呈现具有特征性的“阶梯阶梯”(DNA ladder)样条带外观样条带外观 坏死细胞则因坏死细胞则因DNA的随机降解却常出的随机降解却常出 现弥散样外观现弥散样外观DNA断裂的检测J Clin Pathol:Mol Pathol 2000;53:5563J Clin Pathol:Mol Pathol 2000;53:5
14、563琼脂糖电泳法琼脂糖电泳法 缺点:缺点:目前已被更为敏感的同位素标记、目前已被更为敏感的同位素标记、原位末端标记技术所替代原位末端标记技术所替代DNA断裂的检测细胞凋亡检测 形态学观察 细胞膜完整性 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测 流式细胞仪检测(流式细胞仪检测(flow cytometry,FCM)几乎所有凋亡细胞的特征性代谢、生几乎所有凋亡细胞的特征性代谢、生化和分子特点都可利用化和分子特点都可利用FCM的单参数和的单参数和/或或多参数分析进行检测多参数分析进行检测 优点:优点:单个细胞分散相中辨别凋亡细胞;单个细胞分散相中辨别凋亡细胞;快速、准确;应用范围广快速、准确;应用范
15、围广快速准确的定量分析细胞凋亡检测 细胞膜完整性 形态变化 DNA断裂 凋亡定量检测 凋亡定位检测Annexin V检测技术检测技术原理原理:磷脂酰丝氨酸(磷脂酰丝氨酸(PSPS)外翻是早期凋)外翻是早期凋 亡细胞的重要形态特征之一,而依亡细胞的重要形态特征之一,而依 赖赖CaCa2+2+的磷脂结合蛋白的磷脂结合蛋白Annexin VAnnexin V则则 具有与具有与PSPS高亲和结合特性,将其作高亲和结合特性,将其作 为检测细胞膜表面为检测细胞膜表面PSPS的敏感探针试的敏感探针试 剂,用于凋亡细胞检测剂,用于凋亡细胞检测 敏感的定位检测Annexin V检测技术检测技术优点优点:1 对凋
16、亡细胞进行定性及定位检测对凋亡细胞进行定性及定位检测 2 同时使用膜非通透性同时使用膜非通透性DNA染料如染料如 PI等,就能从等,就能从Annexin V染色细染色细 胞中将凋亡和坏死细胞区别开胞中将凋亡和坏死细胞区别开 来:凋亡细胞来:凋亡细胞(-),坏死细胞,坏死细胞(+)敏感的定位检测Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PIDNA检测技术检测技术原理:根据原理:根据DNADNA聚合酶能够填补双链聚合酶能够填补双链DNADNA中中 单链的碱基缺失部分的基本原理,单链的碱基缺失部分的基本原理,应用同位素或非同位素(如生物
17、应用同位素或非同位素(如生物 素,素,FITCFITC等)标记的三磷酸核苷酸等)标记的三磷酸核苷酸 (dNTPdNTP)形成新的)形成新的DNADNA,以了解,以了解DNADNA 是否断裂和发生是否断裂和发生DNADNA断裂的细胞数量断裂的细胞数量原位末端标记检测优点:优点:常用荧光素常用荧光素FITCFITC标记物,故可以标记物,故可以 通过通过FCMFCM或荧光显微镜检测相应细或荧光显微镜检测相应细 胞的携带荧光强度,进行快速定胞的携带荧光强度,进行快速定 性、定位、定量及大批量细胞悬液性、定位、定量及大批量细胞悬液 或涂片的回顾性研究,是当前较流或涂片的回顾性研究,是当前较流 行的一类细
18、胞凋亡评判方法行的一类细胞凋亡评判方法原位末端标记检测 标记方法标记方法(1 1)DNA DNA 聚合酶聚合酶I I或或Klenow Klenow 大片段介导的原位大片段介导的原位缺口平移缺口平移(in situ nick translation(in situ nick translation,INST)INST)(2 2)末端)末端DNADNA转移酶转移酶dUTPdUTP缺口末端标记法缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick
19、endlabeling,mediated dUTP nick endlabeling,TUNEL)TUNEL)原位末端标记检测TUNELTUNEL法的优点法的优点1 1 定性和定位:定性和定位:对完整的单个凋亡细胞核或凋对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反映凋亡细胞亡小体进行原位染色,能准确的反映凋亡细胞最典型的生物化学和形态特征最典型的生物化学和形态特征2 2 可用于多种来源标本:可用于多种来源标本:如细胞悬液、福尔马如细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等3 3 操作简单,灵敏度高:操作简单,灵敏度高:直接标记步骤少,操
20、直接标记步骤少,操作简便,且间接标记有信号放大的作用作简便,且间接标记有信号放大的作用 原位末端标记检测1 1 端粒酶检测:端粒酶检测:90%90%的凋亡都具有端粒酶活性的凋亡都具有端粒酶活性2 mRNA2 mRNA水平检测:水平检测:通过检测通过检测fas,Bax-fas,Bax-和和 bcl-Xbcl-X基因的基因的 mRNAmRNA表达水平可反映细胞凋亡的水平表达水平可反映细胞凋亡的水平 3 3 细胞内氧化还原状态:细胞内氧化还原状态:谷胱甘肽状态检测谷胱甘肽状态检测4 细胞色素细胞色素C定位检测:定位检测:细胞色素细胞色素C存在于线粒体存在于线粒体内外膜之间,凋亡信号刺激使其从线粒体释
21、放至细内外膜之间,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞质,结合胞质,结合Apaf-1 启动级联反应启动级联反应5 线粒体膜电位变化:线粒体膜电位变化:线粒体膜电位耗散启动凋亡线粒体膜电位耗散启动凋亡其它凋亡检测方法细胞凋亡检测方法小结定性和定量定性和定量定定 性:性:琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳、形态学观察(普泳、形态学观察(普通光学显微镜、透射通光学显微镜、透射电子显微镜和荧光显电子显微镜和荧光显微镜)微镜)定量或半定量:定量或半定量:流式流式细胞仪法、原位末端细胞仪法、原位末端标记法、标记法、ELISA定量、定量、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳区分凋亡与坏死区分凋亡与坏死可区分:可区分:琼脂糖凝
22、胶电琼脂糖凝胶电泳、形态学观察(透射泳、形态学观察(透射电子显微镜最可靠)、电子显微镜最可靠)、PI双染色法流式细胞仪双染色法流式细胞仪检测检测无法区分:无法区分:原位末端标原位末端标记法、记法、PI单染法流式细单染法流式细胞检测胞检测 细胞凋亡检测方法小结标本来源不同标本来源不同组织:组织:主要用形态学主要用形态学方法方法(HE染色,透射染色,透射电镜、石蜡包埋组织电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标切片进行原位末端标记,记,ELISA或将组织或将组织碾碎消化做琼脂糖凝碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳胶电泳)培养细胞:培养细胞:几乎所有几乎所有方法方法凋亡时期不同凋亡时期不同早期:早期:细胞外膜磷脂
23、酰细胞外膜磷脂酰丝氨酸的检测、细胞内丝氨酸的检测、细胞内氧化还原状态改变检测、氧化还原状态改变检测、细胞色素细胞色素C定位检测、定位检测、线粒体膜电位变化的检线粒体膜电位变化的检测测晚期:晚期:原位末端标记法、原位末端标记法、琼脂糖凝胶电泳、端粒琼脂糖凝胶电泳、端粒酶检测酶检测主 讲 内 容细胞凋亡特点细胞凋亡检测细胞凋亡与肿瘤发生调控机制凋亡发生调控机制 凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因凋亡发生调控机制 凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因诱导启动信号传递凋亡实施吞噬搬运各种凋亡诱导分子各种凋亡诱导分子(细胞内细胞内/外外)
24、线粒体途径线粒体途径(P53 bcl-2(P53 bcl-2家族家族)死亡受体途径死亡受体途径(Fas-Fas(Fas-Fas配体配体)Caspase 8Caspase 8Caspase 9Caspase 9Caspase 3Caspase 3细胞凋亡细胞凋亡 1 接受凋亡信号 2 凋亡调控分子间的相互作用 3 蛋白水解酶(Caspases)的活化 4 凋亡的级联反应凋亡发生过程诱导期:诱导期:诱导期是由特定的凋亡诱导信号所诱导期是由特定的凋亡诱导信号所 决定的决定的效应期:效应期:活化的活化的“中央处理器中央处理器”(central central executioner execution
25、er)启动和)启动和“宣判宣判”细胞细胞迅迅 速进入降解期速进入降解期降解期:降解期:出现特征性形态学和生物化学改变出现特征性形态学和生物化学改变凋亡过程分期凋亡全过程需时约数分钟至数小时不等凋亡全过程需时约数分钟至数小时不等从凋亡信号转导到凋亡执行的各个阶段都有负调控因子从凋亡信号转导到凋亡执行的各个阶段都有负调控因子存在,以形成完整的反馈环路,使凋亡过程受到精确严存在,以形成完整的反馈环路,使凋亡过程受到精确严密的调控密的调控 凋亡发生调控机制 凋亡发生过程 凋亡相关因素 凋亡调控机制 凋亡信号通路 凋亡调控基因(一)诱导性因素(一)诱导性因素 细胞凋亡是一个程序化的过程,正常情况下细胞凋
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