最新基因结构与表达分析的基本策略课件.ppt
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1、2 2分子生物学的三大核心技术分子生物学的三大核心技术DNADNA序列分析序列分析DNADNA测序,测序,19771977聚合酶链式反应聚合酶链式反应DNADNA扩增,扩增,19851985DNADNA重组技术重组技术基因克隆,基因克隆,197319739掺入掺入N个核苷酸个核苷酸DNA合成反应模式图合成反应模式图10DNADNA单链模板单链模板引物引物 掺入掺入ddNTPddNTP延伸的新合成链延伸的新合成链 末端终止末端终止111.双脱氧末端终止法原理双脱氧末端终止法原理 DNADNA合成反应中,合成反应中,ddNTPddNTP不存在不存在3-OH3-OH末端末端,故不能与下一个核苷酸,故
2、不能与下一个核苷酸的的5-5-磷酸基团磷酸基团形成形成33,5-5-磷酸二磷酸二酯键,导致酯键,导致DNADNA新链的延伸提前终止于新链的延伸提前终止于ddNTPddNTP 。12ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPA G C T5 T4711G A A T G A 3ACG CT132.DNA2.DNA测序主要步骤测序主要步骤14A A反应管反应管G G反应管反应管G G反应管反应管T T反应管反应管C C反应管反应管T T反应管反应管1516 G A T C17 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 单链单链DNADNA模板的制备模板的制备 DN
3、ADNA模板与测序引物退火模板与测序引物退火 掺入法标记反应掺入法标记反应 延伸延伸-终止反应终止反应 放射自显影放射自显影 阅读测序结果阅读测序结果测序步骤测序步骤 18(二)(二)DNA测序自动化原理测序自动化原理 采用采用4种不同的荧光分别标记种不同的荧光分别标记4种种ddNTP终止反应产物,替代放射终止反应产物,替代放射性同位素标记是实现性同位素标记是实现DNA测序自动测序自动化的基础。化的基础。19ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5 TG A A T G A 3ACG CT2021表示一个表示一个SNP位点,该位点出现了双峰,对应的核苷酸分位点
4、,该位点出现了双峰,对应的核苷酸分别为别为C和和T,因此该位点为因此该位点为CT杂合型,如果该位点只有一杂合型,如果该位点只有一个峰个峰C或者或者T,则该位点基因型为,则该位点基因型为CC或或TT纯合型纯合型22DNA自动测序步骤自动测序步骤 4种不同荧光染料标记终止物种不同荧光染料标记终止物ddNTPsSanger测序反应测序反应反应产物反应产物同一同一泳道电泳分离泳道电泳分离 激光激发不同大小激光激发不同大小DNA片段上的荧光片段上的荧光分子,发射出四种不同波长的荧光分子,发射出四种不同波长的荧光 荧光信号采集、计算机分析与荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序自动排序23Dye lab
5、eled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 24 与末端终止法不同,与末端终止法不同,化学化学降解法是建立在对原有降解法是建立在对原有DNADNA的的化学降解过程基础上。化学降解过程基础上。(三)化学降解法(三)化学降解法25 将待测将待测DNADNA片段片段33或或55端进行同位素端进行同位素标记,标记的标记,标记的DNADNA片段分成五个反应,分别片段分成五个反应,分别用不同的化学试剂处理,造成碱基特异性用不同的化学试剂处理,造成碱基特异性切割,使切割,使DNADNA片段分别于某一种(类)碱基片段分别于某一种(类)碱基处断裂。电泳分离处断
6、裂。电泳分离5 5组组DNADNA混合物,放射自混合物,放射自显影检测末端标记的显影检测末端标记的DNADNA链的电泳区带位置。链的电泳区带位置。化学降解法化学降解法原理原理26 化学降解化学降解G G反应模式图反应模式图 硫酸二甲酯硫酸二甲酯哌啶哌啶MetMetMetMet27最新测序技术最新测序技术 454技术技术(Roche)焦磷酸测序(焦磷酸测序(Pyrosequencing)Solexa测序技术测序技术(Illumina)SOLiD技术技术(ABI)连接法测序连接法测序28举例:举例:Solexa测序测序HiSeq 200029 Solexa 测序:在一个反应中同时加入测序:在一个反
7、应中同时加入 4 种核苷的标签,采用边合成边测序种核苷的标签,采用边合成边测序(SBS sequencing by synthesis)。)。完成人类基因组草图不同测序仪的比较图完成人类基因组草图不同测序仪的比较图30二、核酸分子杂交(Nucleic Acid Hybridization)(一)(一)Southern印迹杂交:检测印迹杂交:检测DNA (Southern blot hybridization)Southern EM,1975(二)(二)Northern印迹杂交:检测印迹杂交:检测RNA (Northern blot hybridization)Stark GR,197731核酸
8、分子杂交原理核酸分子杂交原理 标记的标记的单链核酸探针单链核酸探针与待检测的与待检测的靶单链靶单链DNA或或RNA局部互补结合形成局部互补结合形成杂交双链。杂交双链。应用:应用:核酸靶核酸靶DNA或或RNA序列的序列的定性与定量分析。定性与定量分析。323333印迹技术印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到大分子转移到NCNC等各种膜上,使之成为固等各种膜上,使之成为固相化分子。相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹,因此称之为的墨迹,因此称之为“blottingblotting”,译为译为印迹技术。印迹
9、技术。3434探针技术探针技术 用放射性核素、生物素或荧光染料标用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为链被称为“探针探针”。探针可以与固定在探针可以与固定在NCNC膜上的核苷酸结膜上的核苷酸结合,判断是否有同源的核酸分子存在。合,判断是否有同源的核酸分子存在。35Southern印迹杂交原理印迹杂交原理 将电泳分离的将电泳分离的待测待测DNA片段结合到片段结合到一定的固相支持物上,然后与存在于液一定的固相支持物上,然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。相中标记的核酸探针进行杂交的过程。(一)(一)Souther
10、n印迹杂交印迹杂交应用:应用:DNADNA(基因组(基因组DNADNA)分子的定性或定)分子的定性或定 量分析。量分析。361.制备基因组制备基因组DNA2.用限制性内切核酸酶消化基因组用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3.琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段酶切片段4.凝胶预处理凝胶预处理(如强碱,(如强碱,DNA双链变为单链)双链变为单链)5.Southern 印迹转移印迹转移 6.标记核酸探针、探针与标记核酸探针、探针与DNA片段杂交片段杂交7.杂交结果显示杂交结果显示 Southern印迹杂交基本过程印迹杂交基本过程37Southern印迹杂交示意图印迹杂交示意图38
11、将电泳分离的将电泳分离的待测待测DNA片段结合到片段结合到一定的固相支持物上,然后与存在于液一定的固相支持物上,然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。相中标记的核酸探针进行杂交的过程。3940 地中海贫血的地中海贫血的Southern blot 基因诊断基因诊断(1)仅一条染色体上的一个)仅一条染色体上的一个基因缺失或缺陷,则基因缺失或缺陷,则链的合成部分受抑制,称链的合成部分受抑制,称为为+地贫;地贫;(2)每条染色体上的)每条染色体上的2个个基因均缺失或缺陷,称为基因均缺失或缺陷,称为0地贫;地贫;(3)1、2序列基本一致;序列基本一致;基因不同程度的缺失可引起不同类型的基因不同
12、程度的缺失可引起不同类型的 地中海贫血。地中海贫血。12+0+0 0 041BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe 地中海贫血的直接基因诊断地中海贫血的直接基因诊断42 /-/-/-/-正常正常 缺缺1 缺缺2 缺缺3 缺缺414kb10kb43(二)(二)Northern印迹杂交印迹杂交 (Northern blot hybridization)指将指将RNA变性及电泳分离后,并转变性及电泳分离后,并转移到固相支持物上,用杂交反应来鉴定移到固相支持物上,用杂交反应来鉴定其中特定其中特定mRNA分子的含量及其大小。分子的含量及其大小。用于用于mRNA进行定
13、性和定量分析。进行定性和定量分析。44RNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18S应用举例应用举例45GAPDH0d 2d 4d 6d 8dNorthern blot 杂交分析杂交分析mRNA的表达的表达靶靶 mRNA3-磷酸甘油醛脱氢酶 4646三、其他杂交技术三、其他杂交技术1.斑点杂交斑点杂交(dot blot hybridization)将将RNA或或DNA变性后变性后直接点样于硝酸纤维素膜直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,用于基因组或尼龙膜上,用于基因组中特定基因及其表达的定中特定基因
14、及其表达的定性及定量研究。性及定量研究。47472.原位杂交原位杂交(in situ hybridization)用标记的核酸探用标记的核酸探针与组织切片或细胞针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序中的待测核酸互补序列杂交,可对核酸进列杂交,可对核酸进行定性、定位和相对行定性、定位和相对定量分析。定量分析。48 3 3核酸酶核酸酶S1 S1 保护分析法保护分析法 (nuclease S1 protection assay (nuclease S1 protection assay)单链单链DNADNA探针探针与待测与待测RNARNA形成形成DNA/RNADNA/RNA杂交双链,加入核酸酶杂交双链
15、,加入核酸酶S1S1专专一性地降解未形成杂交体的一性地降解未形成杂交体的DNADNA或或RNARNA单链,单链,DNA/RNADNA/RNA杂交双链则受到杂交双链则受到保护而不被降解。保护而不被降解。494RNA酶保护分析法酶保护分析法 (RNase protection assay,RPA)50RPA基本程序:基本程序:待测待测RNARNA的分离的分离体外转录标记体外转录标记RNARNA探针探针待测待测RNARNA与探针与探针RNARNA进行液相杂交进行液相杂交 RNA酶消化酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分离不同大小杂交片段凝胶电泳分离51三、聚合酶链式反应三、聚合酶链式反应(Polymer
16、ase Chain Reaction,PCR)(一)(一)PCRPCR技术原理技术原理(二)耐热(二)耐热DNADNA聚合酶聚合酶(三)(三)PCRPCR引物及设计原则引物及设计原则(四)(四)PCRPCR条件的优化条件的优化 (五)(五)PCRPCR改进技术改进技术(六)其它(六)其它PCR技术技术52聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR):(一)(一)PCRPCR技术原理技术原理 Mullis K.1985年年发明的一种模拟天然发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸复制过程的核酸体外扩增技术。体外扩增技术。The Nobel Prize in Chemistry 1993 53The re
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