第三节基因工程中的酶课件.ppt
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- 关 键 词:
- 三节 基因工程 中的 课件
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1、1第三节基因工程中的酶学第三节基因工程中的酶学了解各种酶在基因工程了解各种酶在基因工程中的作用中的作用掌握限制性内切酶和连掌握限制性内切酶和连接酶的基本特性接酶的基本特性逆转录酶在基因工程中逆转录酶在基因工程中参与了哪些反应?参与了哪些反应?23重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶I反转录酶多聚核苷酸激酶末端转移酶碱性磷酸酶识别特异序列,切割DNA催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键,是DNA切口封合或是DNA片段连接合成双链cDNA的第二条链缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端合成cDNA代替DNA聚合酶I进行填补,标记
2、或DNA序列分析催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化,或标记探针在3羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基4第一第一 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNADNA分子中的某种分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割特定核苷酸序列,并由此切割DNADNA双链结双链结构的核苷酸内切酶。构的核苷酸内切酶。5一、限制性内切酶概念的提出一、限制性内切酶概念的提出寄主控制的限制(寄主控制的限制(restrictionrestriction)与修饰)与修饰 (modification)(modificati
3、on)现象:现象:人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称(制与修饰现象简称(R/MR/M体系)。体系)。细菌的细菌的R/MR/M体系类似于免疫系统,能体系类似于免疫系统,能辨别自身的辨别自身的DNADNA与外来的与外来的DNADNA,并能使后,并能使后者降解掉。者降解掉。6 为什么生物体产生的限制酶,不会损失自身的DNA呢?7R/MR/M体系:体系:寄主是由两种酶活性配合完成的寄主是由两种酶活性配合完成的 一一种是修饰的甲基转移酶种是修饰的甲基转移酶 另另一种是核酸内切限制
4、酶一种是核酸内切限制酶8 E.E.colicoliB B含有含有EcoBEcoB核酸酶核酸酶和和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶 以以(k)(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.E.colicoliB B为例为例9限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外源外源DNADNA切成小片断。切成小片断。(1 1)限制()限制(RestrictionRestriction)10细菌自身的细菌自身的DNADNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化甲基化修饰所保护,不能被自身的限制性内切修饰所保护,不能被自身的限制性内切酶识别切割。酶识别切割。(2 2)修饰()修饰(ModificationModi
5、fication)DamDam甲基化酶甲基化酶G GA ATC TC 腺嘌呤腺嘌呤N6N6位置引入甲基位置引入甲基 DcmDcm甲基化酶甲基化酶C CC CAGGAGG或或C CC CTGGTGG序列在第二个序列在第二个C C上上C C5 5位置上引入甲基位置上引入甲基1112 R/MR/M体系的作用:体系的作用:保护自身的保护自身的DNADNA不受限制;不受限制;破坏外源破坏外源DNADNA使之迅速降解使之迅速降解13切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱,具有重大应用价值(“分子手术刀”)。14I I 型限制性内切酶型限制性内切酶 目前鉴定出目前鉴定出三种不同类型三种不同类型的
6、限制性内切酶。的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型II II 类限制性内切酶类限制性内切酶 IIIIII类限制性内切酶类限制性内切酶 不适用于基因工程。只在肠道菌不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。中发现。基因工程的工具酶基因工程的工具酶 切割位点不在识别位点,一般离识别位点切割位点不在识别位点,一般离识别位点25bp27bp,对分子克隆操作亦无实用意义对分子克隆操作亦无实用意义 15首先由首先由H.O.SmithH.O.Smith和和K.W.WilcoxK.W.Wilcox在在19701970年从流感嗜血菌中分离出来。年从流感嗜血菌中分离出来。(1 1)识别位点序列)
7、识别位点序列未甲基化修饰未甲基化修饰的的双链双链DNADNA上的特殊靶序上的特殊靶序列(多数是回文序列)。列(多数是回文序列)。II II类限制性内切酶类限制性内切酶 分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind Hind 16(2 2)切割位点)切割位点切开切开双链双链DNADNA。形成。形成粘性末端粘性末端(sticky sticky endend)或)或平齐末端平齐末端(blunt endblunt end)。)。识别位点处。识别位点处。17(3 3)平末端()平末端(blunt endblunt end)两条链上的断裂位置是处在一两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心个对称结构的中心,
8、这样形式的这样形式的断裂是形成具有平末端的断裂是形成具有平末端的DNADNA片断。不易重新环化。片断。不易重新环化。18l两条链上的断裂位置是交错两条链上的断裂位置是交错地,但又是围绕着一个对称地,但又是围绕着一个对称结构中心,这样形成的断裂结构中心,这样形成的断裂结果形成具有粘性末端的结果形成具有粘性末端的DNADNA片段片段(4 4)粘性末端()粘性末端(sticky endssticky ends,cohensive endscohensive ends)19含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。分两种类型:分两种类型:5 5端凸出(如端凸出(如EcoR IEcoR I切点
9、)切点)G GAATTCAATTC CTTAACTTAA G G G G AATTCAATTC CTTAACTTAAG G5-5-3-3 3-3-5-5 5-5-3-3 3-3-5-5 3-3-55-20CTGCAG 3端凸出(如端凸出(如Pst I切点)切点)GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 5-3-21与DNA结合的限制性内切酶BamH 1的结构。限制性内切酶识别双链DNA序列5-GGATCC-3,并在两个GG残基之间切开磷酸二酯键。这个切割形成带有两个有5粘性末端的DNA片段。这种蛋白质是有相同的亚基组成的二聚体。22 连接便利连接便利 (5
10、5)粘性末端的意义)粘性末端的意义i i)不同的)不同的DNADNA双链:双链:只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii ii)同一个)同一个DNADNA分子内连接:分子内连接:通过两个相同的粘性末端可以连接通过两个相同的粘性末端可以连接成成环形分子环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的多。2324 补平成平齐末端补平成平齐末端 55末端标记末端标记凸出的凸出的55末端末端可用可用DNADNA多核苷酸激多核苷酸激酶进行酶进行3232P P标记。标记。粘性末端可以用粘性末端可以用DNADNA聚合酶补平成平齐聚合酶补平成平齐末端。末端。25l
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