第11章紫外可见分光光度法-分析化学讲义课件.ppt

1、第第11章章 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法Ultraviolet and Visible Spectrophotometry可见光的色散与互补可见光的色散与互补/nm颜色颜色互补光互补光400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿白光由一系列不同颜色（波长）白光由一系列不同颜色（波长）的光组成。的光组成。两种适当颜色（波长）的光按两种适当颜色（波长）的光按一定强度比例混合可获得白光。一定强度比例混合可获得白光。

2、物体的颜色是如何产生的？物体的颜色是如何产生的？物体所呈现出的是不同结构的物质对白光物体所呈现出的是不同结构的物质对白光选择性吸收选择性吸收后后透透过过（透明物体）或（透明物体）或反射反射（不透明物体）的（不透明物体）的互补光的颜色互补光的颜色。物质结构决定可吸收波长及能力物质结构决定可吸收波长及能力定性及结构分析基础定性及结构分析基础 物质含量决定颜色的深浅物质含量决定颜色的深浅定量基础定量基础基于物质对光的选择性吸收现象即可建立起相应的分析测基于物质对光的选择性吸收现象即可建立起相应的分析测定的方法：如定的方法：如UV-Vis光谱法、光谱法、IR等。等。紫外紫外-可见分光光度法（可见分光光

3、度法（UV-Vis）分子光谱分子光谱方法，利用的是分子对外来辐射的方法，利用的是分子对外来辐射的吸收吸收特性；特性；涉及涉及分子外层电子分子外层电子的能级跃迁；光谱区在的能级跃迁；光谱区在200800 nm；UV-Vis主要用于分子的主要用于分子的定量分析定量分析，亦可作为化合物（尤其，亦可作为化合物（尤其是有机化合物）定性鉴定的辅助手段（有机四大波谱之是有机化合物）定性鉴定的辅助手段（有机四大波谱之一）；还可用来研究物质间相互作用（结合比、结合常数一）；还可用来研究物质间相互作用（结合比、结合常数的测定等）；是高效液相色谱法（的测定等）；是高效液相色谱法（HPLC）的常规检测器）的常规检测器

4、（80%的有机化合物具有的有机化合物具有UV吸收）。吸收）。11-1 紫外紫外-可见吸收光谱概述（可见吸收光谱概述（1）UV-Vis光谱的形成光谱的形成（本章以透射光谱为主）（本章以透射光谱为主）运动分子的外层电子运动分子的外层电子吸收某波长的外来辐射吸收某波长的外来辐射产生电子产生电子能级跃迁能级跃迁外来辐射的强度减小外来辐射的强度减小分子吸收光谱。分子吸收光谱。t0IIlgA 记录记录吸光度吸光度A随波长变化的曲线随波长变化的曲线即得到相应紫外可见吸收光谱。即得到相应紫外可见吸收光谱。激发态分子不稳定，当其返回基态时能量如何释放？激发态分子不稳定，当其返回基态时能量如何释放？光源光源单色器

5、单色器样品分子样品分子检测器检测器读出装置读出装置0I tI 激发态分子激发态分子典型的典型的UV-Vis光谱图光谱图末端吸收末端吸收最强峰最强峰肩肩峰峰峰谷峰谷次强峰次强峰A max min nm 20011-1 紫外紫外-可见吸收光谱概述（可见吸收光谱概述（2）定量分析基础定量分析基础420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640A1.00.50 标准曲线标准曲线标准加入标准加入样样品品池池1c2c3c4cclckA 任意波长下，吸光度任意波长下，吸光度A与待测试样浓度与待测试样浓度c均存在均存在正比关系，应该如何选择正比关系，应该如何选择测

6、定波长？测定波长？1c2c3c4c11-1 紫外紫外-可见吸收光谱概述（可见吸收光谱概述（3）定性定性/结构分析基础结构分析基础Uv-Vis的吸收峰数目、位置及强度、谱带形状与物质分子内部结构密切相关，可的吸收峰数目、位置及强度、谱带形状与物质分子内部结构密切相关，可用物质的定性及结构分析。但用物质的定性及结构分析。但Uv-Vis谱图简单，特征性不强，多为辅助手段谱图简单，特征性不强，多为辅助手段UV-Vis光谱与官能团之间的关系光谱与官能团之间的关系（a）胆甾醇胆甾醇（b）异丫丙基丙酮异丫丙基丙酮UV-Vis所反映的是官能团的信息所反映的是官能团的信息11-2 基本原理基本原理11-2-1

7、带状光谱的成因带状光谱的成因（自学）（自学）11-2-2 有机化合物的紫外可见光谱有机化合物的紫外可见光谱11-2-3 无机化合物的紫外可见光谱无机化合物的紫外可见光谱（自学）（自学）11-2-4 常用术语常用术语11-2-5 影响紫外可见光谱的因素影响紫外可见光谱的因素11-2-1 带状光谱的成因（带状光谱的成因（1）UV-Vis分子光谱呈现出较宽的谱线轮廓？分子光谱呈现出较宽的谱线轮廓？E/hcv/c 分子内部存在三种量子化能级：电子能级分子内部存在三种量子化能级：电子能级Ee，振动能级，振动能级Ev，转动能级转动能级Er，其能量可表示为：，其能量可表示为：r,v,eEe,v,r分别为电子

8、能级、振动能级和转动能级的量子数，其数值分别为电子能级、振动能级和转动能级的量子数，其数值取取0（基态），（基态），1（第一激发态），（第一激发态），n（正整数）（正整数）11-2-1 带状光谱的成因（带状光谱的成因（2）分子内部各量子化间隔如下：分子内部各量子化间隔如下：Ee最大：最大：1-20 eV Ev次之：次之：0.05-1 eV Er最小：最小：0.05 eV外层电子处于基态的分子，其振动、转动能外层电子处于基态的分子，其振动、转动能级可能处于各种状态：级可能处于各种状态：外层电子处于第一激发态的分子，其振动、外层电子处于第一激发态的分子，其振动、转动能级亦可能处于各种状态：转动能级

9、亦可能处于各种状态：r,v,0E r,v,1E只要入射光的能量等于：只要入射光的能量等于：即可被分子吸收，并发生电子能级的跃迁。即可被分子吸收，并发生电子能级的跃迁。r,v,1E r,v,0E 11-2-1 带状光谱的成因（带状光谱的成因（3）rvEEEe 固定值固定值可变值可变值可见：可见：能够被分子吸收并引起外层电子跃迁的并不是单一波长的辐射，能够被分子吸收并引起外层电子跃迁的并不是单一波长的辐射，而是一系列能量差为而是一系列能量差为 Er的辐射，对应得将产生间隔很近（对应的辐射，对应得将产生间隔很近（对应UV区约区约0.2 nm）的一系列吸收谱线，其中心波长）的一系列吸收谱线，其中心波长

10、 max所对应的能量由所对应的能量由 Ee决定。决定。此外：此外：溶液中相邻分子间的碰撞导致分子各种溶液中相邻分子间的碰撞导致分子各种能级的细微变化，也会引起谱带的进一步加宽能级的细微变化，也会引起谱带的进一步加宽和汇合，从而使得分子光谱通常呈现为一定宽和汇合，从而使得分子光谱通常呈现为一定宽度的带状光谱。度的带状光谱。r,v,1E r,v,0E 11-2-2 有机化和物的有机化和物的UV-Vis光谱（光谱（2）有机化合物的有机化合物的UV-Vis光谱取决于分子结构及其价电子光谱取决于分子结构及其价电子的性质，其特征性可用的性质，其特征性可用 max和和 max表示。表示。价电子类型价电子类型

11、（以（以HCHO为例）为例）n成键轨道：成键轨道：、反键轨道：反键轨道：*、*非键轨道非键轨道：n11-2-2 有机化和物的有机化和物的UV-Vis光谱（光谱（2）各轨道能级高低顺序：各轨道能级高低顺序：n *n *n *非键轨道非键轨道成键轨道成键轨道反键轨道反键轨道 (nm)*n*禁阻跃迁且能量间隔较高（远紫外区），通常不考虑禁阻跃迁且能量间隔较高（远紫外区），通常不考虑 不含共轭体系的分子（不含共轭体系的分子（1）饱和碳氢化合物饱和碳氢化合物仅能发生能级差很大的仅能发生能级差很大的跃迁，吸收波长属远紫外区，如跃迁，吸收波长属远紫外区，如CH4和和CH3-CH3的的 max分别为分别为12

12、5和和135 nm。含饱和杂原子的化合物含饱和杂原子的化合物还能发生还能发生n跃迁，但能级差也较大，除溴化物、碘化物、跃迁，但能级差也较大，除溴化物、碘化物、胺、硫醚、硫醇、二硫化物（胺、硫醚、硫醇、二硫化物（R-S-S-R）在近紫外区有弱吸收）在近紫外区有弱吸收外，大部分该类化合物在近紫外区无明显吸收。外，大部分该类化合物在近紫外区无明显吸收。远紫外区属于真空紫外区，常规远紫外区属于真空紫外区，常规UV-Vis光度计无法测定（即使光度计无法测定（即使能测定无法提供可用信息），因此饱和有机化合物不能用能测定无法提供可用信息），因此饱和有机化合物不能用UV光光谱法进行分析，但常作为溶剂使用。谱法

13、进行分析，但常作为溶剂使用。不含共轭体系的分子（不含共轭体系的分子（2）含非共轭烯、炔基团的化合物含非共轭烯、炔基团的化合物含含 电子，可发生电子，可发生 *跃迁，能级差较跃迁，能级差较跃迁小，但也处跃迁小，但也处在远紫外区，如乙烯和乙炔的在远紫外区，如乙烯和乙炔的 max分别为分别为165和和173 nm，如无助，如无助色团作用，在近紫外区仍无吸收。色团作用，在近紫外区仍无吸收。含不饱和杂原子的化合物（含不饱和杂原子的化合物（C=O、C=N、N=N等等）这类化合物这类化合物4种跃迁均可发生，但仅种跃迁均可发生，但仅n*跃迁的吸收波长处在跃迁的吸收波长处在近紫外区。虽然强度较低（禁阻跃迁），但

14、在紫外鉴定中仍不近紫外区。虽然强度较低（禁阻跃迁），但在紫外鉴定中仍不容忽视。容忽视。n*跃迁通常被称为跃迁通常被称为R带。带。不含共轭体系的分子（不含共轭体系的分子（3）化合物化合物 max/nm 化合物化合物 max/nm CH3OH183150CH3COOH20441CH3Cl173200CH3CONH221460CH3Br204200CH3NNCH33395CH2=CH217514000CH3NO228022CH CH1736000CH3COCH328016 含共轭体系的分子含共轭体系的分子化合物化合物共轭双键数共轭双键数 max/nm（）颜色颜色乙烯乙烯1185/10000无色无色丁

15、二烯丁二烯2217/21000无色无色1,3,5-己三烯己三烯3258/35000无色无色癸五烯癸五烯5335/118000淡黄淡黄二氢二氢-胡萝卜素胡萝卜素8415/21000橙黄橙黄番茄红素番茄红素11470/185000红红随着共轭体系的延长，随着共轭体系的延长，*跃迁的吸收带将明显向长波长移跃迁的吸收带将明显向长波长移动（通常称为动（通常称为K带），吸收强度也随之增强（带），吸收强度也随之增强（10000）共轭的醛、酮、酸、酯、腈、酰胺等化合物同上共轭的醛、酮、酸、酯、腈、酰胺等化合物同上芳香族化合物芳香族化合物E1带带E2带带B带带苯在异辛烷中苯在异辛烷中UV-Vis光谱光谱E1带带

16、E2带带B带带180 nm204 nm255 nm6.0 x1048.0 x1032.0 x102气态或非极性溶剂中，苯及气态或非极性溶剂中，苯及其同系物的其同系物的B带有许多精细结带有许多精细结构，这是由于振动跃迁在基态构，这是由于振动跃迁在基态电子跃迁上的叠加。可用于鉴电子跃迁上的叠加。可用于鉴别芳香族化合物。别芳香族化合物。芳杂环（呋喃、吡咯、噻吩、吡啶）等的芳杂环（呋喃、吡咯、噻吩、吡啶）等的UV-Vis与苯环有一定类似与苯环有一定类似11-2-3 无机化和物的无机化和物的UV-Vis光谱（光谱（1）电荷转移吸收光谱：电荷转移吸收光谱：分子同时具有电子给体部分和电子受分子同时具有电子给

17、体部分和电子受体，能强烈吸收外来的体，能强烈吸收外来的UV或或Vis光，使光，使电子从给体向受体电子从给体向受体相应轨道上跃迁。相应轨道上跃迁。OHFeOHFeSCNFeSCNFeLMLM2h32h3)1b()1n(hbn e（分子内氧化还原）（分子内氧化还原）hvDADA-D:e给予体给予体A:e接受体接受体e许多无机配合物能许多无机配合物能产生这种光谱。产生这种光谱。有机化合物或配合有机化合物或配合物亦可能产生该光谱物亦可能产生该光谱电荷转移吸收光谱的强度大（电荷转移吸收光谱的强度大（104）且谱带宽，适于定量分析。）且谱带宽，适于定量分析。11-2-3 无机化和物的无机化和物的UV-Vi

18、s光谱（光谱（2）配位体场跃迁（配位体场跃迁（dd*,ff*）无配位场无配位场配位场配位场八面体八面体配位场配位场四面体四面体面配位场面配位场正方形平正方形平能级差小（可见区）；吸收弱：能级差小（可见区）；吸收弱：100较少用于定量分析，但可用于配合物结构较少用于定量分析，但可用于配合物结构及键合理论方面的研究。及键合理论方面的研究。11-2-4 UV-Vis中常用术语（中常用术语（1）生色团生色团含含非键或非键或 键键电子，能吸收外来辐射引发电子，能吸收外来辐射引发n-*和和-*跃迁跃迁的结构单元的结构单元称为生色团（如：称为生色团（如：-C=C-、-C=N、-C=O等）等）助色团助色团含有

19、非键电子对含有非键电子对，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。的一些官能团，称之为助色团。FCH3ClBrOHOCH3NH2NHCH3 N(CH3)2 NHC6H5O-CHOCHCHX XNR2SRORBrClmax9585503020助色原因：助色原因：n-共轭或超共轭（烷基，弱）共轭或超共轭（烷基，弱）11-2-4 UV-Vis中常用术语（中常用术语（2）增色增色减色减色红移红移紫移紫移蓝蓝/11-2-5 影响影响UV-Vis光谱的因素光谱的因素共轭效应（核心因素）共轭效应（核心因素）空间效应空间效应pH的影

20、响的影响溶剂的影响溶剂的影响共轭效应（共轭效应（1）1 2 1 2共轭效应（共轭效应（2）化合物化合物乙烯乙烯丁二烯丁二烯己三烯己三烯辛四烯辛四烯结构式结构式CH2=CH2 max185217258296 1.01042.11043.51045.2104 E E E E 4*5*6*3 2 1 3 2 1 4 5*6*7*8*3*4*2 1 1 2*共轭效应（共轭效应（3）En*n *290 nm *210 nmn*4 1n *321 nm *217 nm 2*3脂肪醛的脂肪醛的 *n *2-丁烯醛的丁烯醛的 2 *3 n *3COHR 3CHCHHCOCH 空间效应空间效应A-H；B-CH3

21、；C-CH2CH3；D-CH2CH2CH3；E-CH2CH2CH2CH3；F-2,4,6-三丁基三丁基NO2RpH的影响（的影响（1）苯胺苯胺 pKb=9.3介质介质KB水水230280酸酸203254苯酚苯酚 pKa=9.95介质介质KB水水210.5270碱碱235287 A200250300230280中性中性酸性酸性苯胺苯胺UV吸收光谱图吸收光谱图pH的影响（的影响（2）COHOHHOCOOCOOCOOOHH3sp2sp酸碱条件改变导致物质结构发生变化酸碱条件改变导致物质结构发生变化溶剂的影响（溶剂的影响（1）1.蒸气状态蒸气状态2.环己烷中环己烷中3.水中水中溶剂极性增大，溶质分子吸

22、收峰的振动精细结构逐渐消失溶剂极性增大，溶质分子吸收峰的振动精细结构逐渐消失nm/波长波长吸光度吸光度溶剂的影响（溶剂的影响（2）溶剂极性对溶剂极性对n*和和*跃迁能量的影响跃迁能量的影响无溶剂效应无溶剂效应极性溶剂效应极性溶剂效应 n能能 量量 n溶剂极性对异丙叉丙酮跃迁谱带的影响溶剂极性对异丙叉丙酮跃迁谱带的影响跃迁类型跃迁类型正己烷正己烷氯仿氯仿甲醇甲醇水水n*329 nm315 nm309 nm305 nm蓝移蓝移*230 nm238 nm237 nm243 nm红移红移CHCCCH3CH3H3CO如何估算氢键的强度？如何估算氢键的强度？UV-Vis光谱法中溶剂的选择光谱法中溶剂的选择

23、基本要求基本要求对溶剂有很好的溶解性；对溶剂有很好的溶解性；自身稳定，对溶自身稳定，对溶 质惰性；质惰性；在样品的吸收光谱区无明显吸收；在样品的吸收光谱区无明显吸收；低极性（定性分析低极性（定性分析）溶剂溶剂 截止截止/nm溶剂溶剂 截止截止/nm溶剂溶剂 截止截止/nmCHCl3245乙醚乙醚210苯苯280环己烷环己烷210己烷己烷210CCl4265正丁醇正丁醇210庚烷庚烷210DMF270二氯甲烷二氯甲烷235甲醇甲醇215丙酮丙酮330二氧六环二氧六环235异辛烷异辛烷210吡啶吡啶303乙醇乙醇215水水210硝基甲烷硝基甲烷380常用溶剂的光学透明区常用溶剂的光学透明区11-3

24、 Lambert-Beer定律（定律（1）透射比和吸光度透射比和吸光度 透射比透射比T（透光度、透过率）（透光度、透过率）吸光度吸光度A（光密度（光密度D or O.D.，消光度，消光度E）A与与T的关系的关系0tI/IT （0 T%100）t0I/IlgA （0 A）TlgA A10T 11-3 Lambert-Beer定律（定律（2）前提：入射光为单色光前提：入射光为单色光 Lambert定律（定律（1760）：吸光物质浓度不变）：吸光物质浓度不变 Beer定律（定律（1852年）：光程不变年）：光程不变L-B定律定律lk Ack Aclk Ak、k、k：比例系数，与溶液性质、入射光波长比

25、例系数，与溶液性质、入射光波长及温度有关及温度有关l：光程光程c：吸光物质浓度吸光物质浓度11-3 Lambert-Beer定律（定律（3）比例系数比例系数k的几种表达方式的几种表达方式 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 吸光系数吸光系数a 比吸光系数比吸光系数 A：无量纲；：无量纲；l：cmc：molL-1；：Lmol-1cm-1 clA claA c：gL-1；a：Lg-1cm-1%1cm1E c：%；：100 cm-1 clEA%1cm1%1cm1E摩尔吸光系数摩尔吸光系数 数值上等于吸光物质浓度为数值上等于吸光物质浓度为1 mol L-1，光程为，光程为1 cm时的吸光度时的吸光度（测定该值需

26、用稀的标准溶液）（测定该值需用稀的标准溶液）由吸光物质本身性质决定，当测定条件如入射光波长，溶剂等由吸光物质本身性质决定，当测定条件如入射光波长，溶剂等条件确定时，该值可作为吸光物质的一个特征参数条件确定时，该值可作为吸光物质的一个特征参数（定性）（定性）可用作吸光能力和测定方法灵敏度的度量可用作吸光能力和测定方法灵敏度的度量 5105（高）高）与吸光系数和比吸光系数的换算与吸光系数和比吸光系数的换算M/10a10A%1cm1 M为吸光物质的分子量为吸光物质的分子量11-5 Lambert-Beer定律（定律（4）L-B定律的适用性定律的适用性 入射光为入射光为单色平行光单色平行光 待测物为待

27、测物为均一的稀溶液均一的稀溶液、气体等，无溶质、溶剂及悬浊物引起、气体等，无溶质、溶剂及悬浊物引起的散射的散射局限性：局限性：样品吸光度样品吸光度 A 与光程与光程 l 总是成正比；但总是成正比；但l 一定时，一定时，A 与与 c 并不总是成正比，即会发生并不总是成正比，即会发生Beer定律的偏离！这种偏离由定律的偏离！这种偏离由样样品性质品性质和和仪器自身仪器自身引起的引起的。1.无偏离无偏离2.正偏离正偏离3.负偏离负偏离样品性质影响样品性质影响 浓度过高，吸光质点间距变小而相互影响，以致对特定辐射的浓度过高，吸光质点间距变小而相互影响，以致对特定辐射的吸收能力（吸收能力（）发生变化。）发

28、生变化。（稀溶液：（稀溶液：c0.01 mol L-1）待测组分的离解、缔合、逐级配位、互变异构、光化学反应以待测组分的离解、缔合、逐级配位、互变异构、光化学反应以及与溶剂的相互作用都可能引起对及与溶剂的相互作用都可能引起对Beer定律的偏离。定律的偏离。溶液必须使均相体系！溶液必须使均相体系！胶体、乳胶、悬浮物、沉淀等非均相体胶体、乳胶、悬浮物、沉淀等非均相体系产生的系产生的光散射光散射会引起对会引起对Beer定律的偏离。定律的偏离。离子强度过大或待测样品在待测波长的发射荧光、磷光亦可能离子强度过大或待测样品在待测波长的发射荧光、磷光亦可能引起对引起对Beer定律的偏离。定律的偏离。104/

29、nm亚甲基阳离子水溶液亚甲基阳离子水溶液cbaccc 形成二聚体形成二聚体仪器因素仪器因素（非单色光（非单色光）假设假设入射光仅由测量波长入射光仅由测量波长 x和干扰和干扰 i波长组成，则吸光度波长组成，则吸光度A可用下可用下式表示：式表示：itxti0 x0t0IIIIlgIIlgA lcAB-L ：单色光单色光定律定律lc)i(0lc)x(0)i(0)x(0ix10I10IIIlg lc 仅当仅当 i=x时上式成立，否则产生对时上式成立，否则产生对Beer定律的偏离！定律的偏离！应尽量使入射光应尽量使入射光“带宽带宽”内的内的 保持一致！保持一致！max处测定，灵敏度高，对处测定，灵敏度高

30、，对Beer定定律的符合程度也好律的符合程度也好应根据实际情况调节适当应根据实际情况调节适当“带宽带宽”max lc0t10II 11-4 Lambert-Beer定律（定律（5）吸光度的加和性吸光度的加和性溶液中存在多个吸光物质，且它们溶液中存在多个吸光物质，且它们彼此之间没有相互作用彼此之间没有相互作用时，时，L-B定律可用下式表示：定律可用下式表示：niilc1in21AAAA待测组分吸光度测定及多组分同时测定的理论基础。待测组分吸光度测定及多组分同时测定的理论基础。待测组分吸光度待测组分吸光度A的测定的测定参比参比散射散射反射反射其它成分其它成分溶剂溶剂参比参比t0IIIIlgAAA

31、t0IIIIlgAAAA散射散射反射反射其它成分其它成分溶剂溶剂待测组分待测组分 ttt0t0IIlgIIIIlgIIIIlgAAA参比参比参比参比散射散射反射反射散射散射反射反射参比参比试样试样 选择适当的参比溶液是关键选择适当的参比溶液是关键吸收池也应匹配吸收池也应匹配 T0.5%11-4 紫外紫外-可见分光光度计（可见分光光度计（1）基本部件基本部件光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器光电管、光电倍增管光电管、光电倍增管二极管阵列、二极管阵列、CCD石英：石英：UV-Vis玻璃：玻璃：Vis棱镜棱镜光栅光栅UV：D2 灯灯Vis：WI灯灯UV-Vis：Xe灯灯信号指示信号指示分类

32、：分类：单光束、双光束、双波长、多通道、探头式等单光束、双光束、双波长、多通道、探头式等光源光源氘灯：氘灯：160 375 nm钨灯：钨灯：320-2500 nm氙灯：氙灯：250-700 nm氘氘灯灯示示意意图图 单色器（波长选择器）（单色器（波长选择器）（1）单色器的作用是将单色器的作用是将复合光复合光分解成分解成单色光，单色光，并使相应波长的并使相应波长的单色光进入到检测器。单色光进入到检测器。由入射狭缝和出射狭缝、准直镜以由入射狭缝和出射狭缝、准直镜以及及色散元件色散元件（如棱镜或（如棱镜或光栅光栅等）组成。等）组成。不存在绝对意义上的单色光，均是具有一定宽度不存在绝对意义上的单色光，

33、均是具有一定宽度（带宽）（带宽）的谱带的谱带 使用使用滤光片或干涉仪滤光片或干涉仪+傅里叶变换傅里叶变换方式也可以获得光谱图方式也可以获得光谱图单色器（单色器（2）光栅公式光栅公式 光栅法线光栅法线入射光入射光衍射光衍射光d nsinsind：入射角入射角：衍射角（衍射角（与与 在光栅法线在光栅法线同侧取正，异侧取负同侧取正，异侧取负）d：光栅常数光栅常数n：光谱级数光谱级数：闪耀角闪耀角控制适当的闪耀角控制适当的闪耀角，使最大光强出现在所需级次（通常为，使最大光强出现在所需级次（通常为1级）的光谱上级）的光谱上单色器（单色器（3）光栅分光系统光栅分光系统焦面焦面出射狭缝出射狭缝入射狭缝入射狭

34、缝反射光栅反射光栅凹面镜凹面镜S=DWD：线色散率倒数：线色散率倒数W：狭缝宽度：狭缝宽度S：“单色光单色光”的带的带宽宽检测器检测器光电转换器：光电转换器：将光辐射转化为可测电信号的器件将光辐射转化为可测电信号的器件单道检测器：单道检测器：光电管或光电倍增管等（某一时刻仅能光电管或光电倍增管等（某一时刻仅能检测某一波长的光强，绘制光谱图时需按波长顺序逐检测某一波长的光强，绘制光谱图时需按波长顺序逐一扫描测定，需要一定时间。一扫描测定，需要一定时间。多道检测器：多道检测器：二极管阵列（线检测器）或二极管阵列（线检测器）或CCD面检测面检测器（器（n个单道检测器的集成，能同时检测各个波长的个单道

35、检测器的集成，能同时检测各个波长的光强，可光强，可“瞬间瞬间”完成光谱图的测定）完成光谱图的测定）光电倍增管（光电倍增管（PMT）优点：优点：高灵敏度；响应快；适于弱光测定，甚至可对单一光子响应高灵敏度；响应快；适于弱光测定，甚至可对单一光子响应缺点：缺点：对外加电压变化极为敏感，必须严格控制电压；热发射强，对外加电压变化极为敏感，必须严格控制电压；热发射强，暗电流大；不适合在温度波动较大或高温下工作，不得置于强光暗电流大；不适合在温度波动较大或高温下工作，不得置于强光（如日光）下，否则可永久损坏（如日光）下，否则可永久损坏 PMT！单光束分光光度计单光束分光光度计仪器框图仪器框图特点特点 简

36、单、便宜、操作方便，用于常规定量分析。简单、便宜、操作方便，用于常规定量分析。通常只配备可见光源，玻璃吸收池通常只配备可见光源，玻璃吸收池 通常不具备自动扫描功能，绘制光谱图不方便。通常不具备自动扫描功能，绘制光谱图不方便。722型可见分光光度计型可见分光光度计吸光度吸光度A的测定：的测定：选定波长后，将参比池选定波长后，将参比池放入光路，调节放入光路，调节A=0或或T=100%（目的：把（目的：把入射光强调整为透过参比池的光强），然后入射光强调整为透过参比池的光强），然后把样品池放入光路，即可得样品的吸光度。把样品池放入光路，即可得样品的吸光度。双光束分光光度计（双光束分光光度计（1）仪器框

37、图仪器框图特点特点 通常采用双光源（通常采用双光源（D2、WI），适用全波段（），适用全波段（200-800 nm）具有自动扫描功能具有自动扫描功能 比切光器频率慢的光源和检测器波动不影响测定比切光器频率慢的光源和检测器波动不影响测定入射光交替通过参比池入射光交替通过参比池/样品池进入检测器样品池进入检测器双光束分光光度计（双光束分光光度计（2）吸光度吸光度A的测定的测定 参比池与样品池同时放入参比池与样品池同时放入相应的位置相应的位置，直接可测得，直接可测得A。具有自动扣除具有自动扣除“Baseline”功能，可消除样品池的差异：参比池功能，可消除样品池的差异：参比池和样品池内都装入参比溶液

38、，在设定波段内扫描即可得和样品池内都装入参比溶液，在设定波段内扫描即可得“Baseline”Varian Cary 1E 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计 1和和 2交替通过样品池进入检测器交替通过样品池进入检测器lc)(AAAAlcAAlcA1212222111BlankBlank 特点：特点：不需参比液不需参比液（消除了由参比（消除了由参比池不同和参比溶液选择等产生的误池不同和参比溶液选择等产生的误差）。可用于混浊试样、高浓度试差）。可用于混浊试样、高浓度试样、多组份试样的测定；还可以测样、多组份试样的测定；还可以测定导数光谱。定导数光谱。多通道分光光度

39、计多通道分光光度计无需扫描，可在极短的时间内（无需扫描，可在极短的时间内（104）且无干扰物质存在，可直）且无干扰物质存在，可直接进行定量测定；但部分有机物如氨基酸、糖和大部分无接进行定量测定；但部分有机物如氨基酸、糖和大部分无机离子如机离子如Fe3+、Al3+、NO2-类的类的 很小，该怎么测定呢？很小，该怎么测定呢？显色反应：显色反应：利用利用配位配位（最常见）、氧化还原、偶氮化等反（最常见）、氧化还原、偶氮化等反应使待测物质应使待测物质定量转化定量转化为的为的 足够大的化合物（有色）足够大的化合物（有色）血红血红无色无色无色无色 23FeSCNSCNFeH2O2HCl2+NaNO2SO3

40、HH2N+SO3HNNCl+NaCl+SO3HNNClSO3HH2NH2CH2CHNHCl2.SO3HH2NH2CH2CHNNNHCl2.+HCl无色无色紫红紫红配位显色剂种类配位显色剂种类无机显色剂无机显色剂（SCN-；MoO42-；H2O2）有机显色剂有机显色剂OO型：型：磺基水杨酸磺基水杨酸NN型：邻二氮菲型：邻二氮菲ON型：型：4-(2-吡啶偶氮吡啶偶氮)-间苯二酚间苯二酚 S型：双硫腙型：双硫腙常见无机离子显色剂请参阅常见无机离子显色剂请参阅现代化学试剂手册第四分册现代化学试剂手册第四分册OHCOOHSO3HNNHSNHNHNNNNNHOOH显色剂的选择原则显色剂的选择原则 反应生成

41、物必须有足够大的反应生成物必须有足够大的 和较高的选择性和较高的选择性 反应生成物组成恒定、稳定性好、显色条件易控制反应生成物组成恒定、稳定性好、显色条件易控制 对照性要好，生成物与显色剂的对照性要好，生成物与显色剂的max 60 nm 显色剂确定后，还必须要控制适当的显色条件显色剂确定后，还必须要控制适当的显色条件 原本可直接测定的物质通过适当的显色反应可以进一步提原本可直接测定的物质通过适当的显色反应可以进一步提高灵敏度和选择性，如蛋白质、核酸等。高灵敏度和选择性，如蛋白质、核酸等。ARMR11-5-2 定量分析条件的选择（定量分析条件的选择（1）仪器测量条件仪器测量条件显色反应条件显色反

42、应条件参比溶液的选择参比溶液的选择干扰及消除方法干扰及消除方法（了解）（了解）提高灵敏度及选择性的方法提高灵敏度及选择性的方法（了解）（了解）仪器测量条件（仪器测量条件（1）吸收光谱法仪器的响应值吸收光谱法仪器的响应值 ttIIII 参比参比样品样品 I和和 I：由光源、检测器的波动等各种偶然因素造成：由光源、检测器的波动等各种偶然因素造成TT 对于确定的仪器，对于确定的仪器，T为定值，一般为为定值，一般为0.2 2%T与与c非线性关系。非线性关系。不同不同T对应不同的对应不同的c，相同，相同 T（读数（读数误差）在不同误差）在不同T处产生的处产生的 c也不同。也不同。测定误差测定误差 c/c

43、随着随着T的增加会呈现出何种变化趋势呢？的增加会呈现出何种变化趋势呢？ATlc10T lcA 1086420204060800.70.40.20.1AT%Er仪器测量条件（仪器测量条件（2）lcA T/dT434.0Tln434.0dTlgddA TlgTT434.0AdAcdcEr dcldA AdAcdc 100806040200T%cT 1c 2c 3c T T 1c2c3c%1T 434.0A 仪器测量条件（仪器测量条件（3）当当T36.8，A0.434，Er最小。实际工作中，最好最小。实际工作中，最好 控制控制A在在0.15 1.0（T在在10 70%）之间（）之间（T=1%，Er5

44、%）可通过改变试样量、稀释试液或选用不同光程的吸收池来实现可通过改变试样量、稀释试液或选用不同光程的吸收池来实现 采用高性能高仪器（采用高性能高仪器（T小小）或允许误差大时，）或允许误差大时，A的取值范围可的取值范围可以变宽，但也不宜过浓。以变宽，但也不宜过浓。测定波长的选择：测定波长的选择：max（首选）（首选）出射狭缝宽度的选择（低端仪器无此选项）出射狭缝宽度的选择（低端仪器无此选项）例：例：某钢样含镍约为某钢样含镍约为0.12%，采用丁二酮肟光度法测定，过程如，采用丁二酮肟光度法测定，过程如下：试样溶解后转入下：试样溶解后转入100 mL容量瓶中，显色后定容；然后取部分容量瓶中，显色后定

45、容；然后取部分试液在波长试液在波长470 nm处用处用1 cm吸收池进行测量。如果希望此时的测吸收池进行测量。如果希望此时的测量误差最小，应称取试样多少克？（已知有色配合物的量误差最小，应称取试样多少克？（已知有色配合物的=1.3 104镍的原子量镍的原子量=58.69）解：解：w/Ar100.0lAmNi 试样试样g 16.0%12.0/69.58100.0l103.10.4344 称样的最适质量范围？称样的最适质量范围？显色反应条件（显色反应条件（1）显色剂用量显色剂用量、溶液、溶液pH、反应、反应温度温度及及时间时间等显色反应条件等显色反应条件均会影响到测定结果的重现性和准确度，因此在进

46、行定量均会影响到测定结果的重现性和准确度，因此在进行定量分析前需对其进行优化。分析前需对其进行优化。通常采取通常采取单因素单因素实验法，即在其他影响因素固定的前提下实验法，即在其他影响因素固定的前提下（通过文献调研或预作来确定相应的数值），只改变待考（通过文献调研或预作来确定相应的数值），只改变待考察因素，测定仪器响应（吸光度）并绘制相应曲线，根据察因素，测定仪器响应（吸光度）并绘制相应曲线，根据曲线形状来确定该因素的最佳取值。曲线形状来确定该因素的最佳取值。显色反应条件（显色反应条件（2）显色剂显色剂R用量用量选择曲线平台处对应的显色剂用量作为最佳显色剂用量选择曲线平台处对应的显色剂用量作为

47、最佳显色剂用量常见形式常见形式nMRnRM 显色反应条件（显色反应条件（3）显色反应显色反应pH显色反应的完成度、配位数和待测离子是否发生水解等与显色反应的完成度、配位数和待测离子是否发生水解等与 pH 有关，需通过实验确定最佳有关，需通过实验确定最佳pH值值，缓冲溶液控制。，缓冲溶液控制。pH1pHpH2显色反应条件（显色反应条件（4）确定显色温度及显色时间确定显色温度及显色时间T1(C)T2(C)t1(min)t2(min)T(C)t(min)如果存在其它影响如果存在其它影响因素，也应采用相因素，也应采用相同的实验方法确定同的实验方法确定最适条件。最适条件。21TTT 21ttt 参比溶液

48、的选择（参比溶液的选择（1）试样：待测组分试样：待测组分+基体（与试样来源有关）基体（与试样来源有关）待测液：待测液：待测组分待测组分+基体基体+相关试剂相关试剂+溶剂溶剂理想空白：理想空白：基体（基体（）+相关试剂相关试剂+溶剂溶剂 若测定条件下若测定条件下基体及所用试剂均无吸收基体及所用试剂均无吸收，则可用，则可用溶剂参比溶剂参比 若测定条件下若测定条件下基体无吸收基体无吸收，则可用，则可用试剂参比试剂参比，即，即相关试剂相关试剂+溶溶剂剂（最常用的参比形式）（最常用的参比形式）若存在基体干扰若存在基体干扰，可尽量通过显色剂选择、测定条件优化或掩，可尽量通过显色剂选择、测定条件优化或掩蔽、

49、分离等方式消除基体的影响，这样还可以用试剂参比）蔽、分离等方式消除基体的影响，这样还可以用试剂参比）参比溶液的选择（参比溶液的选择（2）若上述手段无效，则需更换其他参比，譬如：若上述手段无效，则需更换其他参比，譬如：试样参比：试样参比：若若仅存在基体干扰且干扰成分与显色剂不反应仅存在基体干扰且干扰成分与显色剂不反应（显（显色剂和其他试剂无干扰）色剂和其他试剂无干扰），可采用试样参比（除不加显色剂，可采用试样参比（除不加显色剂，其他步骤与试样处理相同）。其他步骤与试样处理相同）。平行操作溶液参比：平行操作溶液参比：用不含被测组分的试样用不含被测组分的试样（基体一致）（基体一致），在，在相同条件下

50、与被测组分进行同样的处理，然后做为参比相同条件下与被测组分进行同样的处理，然后做为参比。系列标准溶液系列标准溶液待测液待测液试剂参比试剂参比本实验所用显色剂和其他试剂在测定波长处无吸收，因此也可用水做参本实验所用显色剂和其他试剂在测定波长处无吸收，因此也可用水做参比（溶剂参比），但实际测定中通常是采用试剂参比。若水样中存在干比（溶剂参比），但实际测定中通常是采用试剂参比。若水样中存在干扰物质，待测液需选用合适的参比溶液或采取适当的手段。扰物质，待测液需选用合适的参比溶液或采取适当的手段。例：邻二氮菲显色法测定水样中微量铁例：邻二氮菲显色法测定水样中微量铁水样处理：用适量水样处理：用适量HCl酸