实验微波辅助提取高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量课件.ppt

1、1 实验目的、内容及要求实验目的、内容及要求 高效液相色谱简介高效液相色谱简介 HPLC的使用与维护的使用与维护 1High Performance Liquid Chromatography1历史回顾；历史回顾；基本原理与概念；基本原理与概念；HPLCHPLC定性与定量方法；定性与定量方法；HPLCHPLC仪器组成。仪器组成。1一、历史回顾一、历史回顾色谱法早在色谱法早在19031903年由俄国植物学家茨维特分离年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用；植物色素时采用；40年代，年代，TLC，纸色谱，柱层析；，纸色谱，柱层析；50年代，年代，GC出现使色谱具备分离和在线分析功能；出现使色谱具

2、备分离和在线分析功能；60年代末年代末 HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大；出现，使色谱分析范围进一步扩大；1 1新型固定相和检测器新型固定相和检测器 2 2联用仪器：联用仪器：GC-MSGC-MS，HPLC-MSHPLC-MS3 3智能化发展智能化发展1937-1972年，年，35年中有年中有12个个Nobel奖是与色谱研究相关的！奖是与色谱研究相关的！1色谱（色谱（Chromatography）一词来源于希腊语中一词来源于希腊语中“chroma”=color;“graphein”=write1二、二、基本原理基本原理 当流动相中携带的混合物流经固定相时，与固定相发生当流动相中携带的混合

3、物流经固定相时，与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，各组分被移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分合，实现混合物中各组分的分离与检测；离与检测；两相及两相的相对运动构两相及两相的相对运

4、动构成了色谱法的基础。成了色谱法的基础。1气体气体 固体固体 气气-固色谱固色谱气体气体 液体液体 气气-液色谱液色谱液体液体 固体固体 液液-固色谱固色谱液体液体 液体液体 液液-液色谱液色谱111 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用K 表示，即：Ms ccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配系数是色谱分离的依据。分配系数是色谱分离的依据。12.分配比分配比(partition radio)k 是指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。在实际工作中，常用来表征色谱分配

5、平衡过程。Ms mmk 组分在流动相中的质量组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量组分在固定相中的质量 1、分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化；2、分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长；3、分配比可以由实验测得。分配比也称：分配比也称：容量因子容量因子(capacity factor)或或 容量比容量比1容量因子与分配系数的关系容量因子与分配系数的关系 式中式中为相比。为相比。容量因子越大，保留时间越长；容量因子越大，保留时间越长；VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；为流动相体积，

6、即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同；的含义不同；气气-液色谱柱：液色谱柱：VS为固定液体积；为固定液体积；气气-固色谱柱：固色谱柱：VS为吸附剂表面容量；为吸附剂表面容量；KVVccVVMVVMMMkmSmsmmSSSSmS 1分配比与保留时间的关系分配比与保留时间的关系 保留因子保留因子(retention factor)：uuRSS us：组分在分离柱内的线速度；u：流动相在分离柱内的线速度；保留因子RS也可以用质量分数表示：kmmmmmRS 1111MsMss 若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别

7、为tR和tM，则：uLtuLt MSR;由以上各式，可得：tR=tM(1+k)MRMMRtttttk 13.3.色谱流出曲线色谱流出曲线（色谱图）（色谱图）混合组分的分离过程及检测器对混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应各组份在不同阶段的响应1关于色谱图的几个基本关于色谱图的几个基本术语术语1、基线、基线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2、保留值、保留值 保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；死时间（tM）：不与固定相作用的气体或液体的保留时间；调整保留时间(tR)：tR=tRtM 13、相对保留值、相对保留值r21 组分2与组分1调整保留值之

8、比：r21=tR2 /tR1=VR2/VR1 相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。色谱流出曲线的意义：色谱流出曲线的意义：色谱峰数色谱峰数=样品中单组份的最少个数；样品中单组份的最少个数；色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据；色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。固定相或流动相选择是否合适的依据。14、区域宽度、区域宽度 用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差标准偏

9、差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度 W1/2=2.354（3）峰底宽峰底宽(Wb)：Wb=4 1W)tt(WW)tt(2)WW(21ttR121212rr21rr21rr 5.5.分离度分离度(Resolution,R)(Resolution,R)同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：总分离效能指标或分辨率。其定义为：利用此式，可直接从利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度色谱流出曲线上求出分离度R R。1R=1.5R=0.75R=1.0响

10、应信号保留时间保留时间 t,minR 越大，相邻组分分离越好。当越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达时，分离程度可达99.7%，因此，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。通常用作是否分开的判据。1三、三、HPLC定性与定量定性与定量1、定性方法、定性方法 a、保留时间 b、与结构表征的检测器联用2、定量方法、定量方法 a、峰高与峰面积 b、外标法 c、内标法 1四、四、HPLC仪器组成仪器组成1早期液相色谱，包括早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径的工作，都是在直径15cm,长长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的玻璃柱中进行的。为保证有一

11、定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在的固定相颗粒直径多在150200 m范围内。即使这样，流速范围内。即使这样，流速仍然很低仍然很低(1 mL/min)，分析时间仍然很长！，分析时间仍然很长！当加压增加流速当加压增加流速(真空或空气泵真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度但柱塔板高度H min也相应增加了！或者说柱效下降了。也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，为了解决分析时间及柱效问题，最为有效地增加柱效的唯最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（一方法是减小填充物的粒径（310 m）！）！粒径减小，液体流过所需压力增大粒径减小，

12、液体流过所需压力增大-高压装置高压装置1分析对象及范围：分析对象及范围：GCGC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，这分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，这些物质占有机物总数的些物质占有机物总数的20%20%；HPLCHPLC可以分析高沸点、高分子可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%80%。流动相的选择：流动相的选择：GCGC采用的流动相中为有限的几种采用的流动相中为有限的几种“惰性惰性”气体，气体，只起运载作用，对组分作用小；只起运载作用，对组分作用小；HPLCHPLC采用的流动相为液体或采用的流动相为液体或

13、各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：操作温度：GCGC需高温；需高温；HPLCHPLC通常在室温下进行。通常在室温下进行。HPLC与与GC的比较的比较11.仪器结构仪器结构 HPLC仪器包括：仪器包括：高压输液装置高压输液装置;进样系统进样系统;分离系统分离系统;检测系统检测系统;此外还配有梯度淋洗、自此外还配有

14、梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。动进样和数据处理装置。12、主要部件、主要部件 (1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（BC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系正相色谱和反相色谱出峰顺序相反正相色谱和反相色谱出峰顺序相反1时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-2-苯酚；苯酚；3-3-乙酰苯；乙酰苯；4-4-硝基苯；硝基苯；5-5-苯甲

15、酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。1b)流动相流动相按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。1在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选

16、择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷

17、溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)1选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。1溶剂溶剂(流动相流动相)组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响1：9,10-蒽醌；蒽醌；2：2-甲基甲基-9,10-蒽醌；蒽

18、醌；3：2-乙基乙基-9,10-蒽醌；蒽醌；4：1,4-二甲基二甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；5：2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O1由于分析物组成复杂，以某一组成的流动相可能使部分待测物得由于分析物组成复杂，以某一组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温采用程序升温（GCGC）和梯度淋洗和梯度淋洗（LCLC）来解决这个问题。来解决这个问题。色谱分离中

19、的问题色谱分离中的问题-梯度洗脱梯度洗脱 11、为什么溶剂和样品要过滤为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。样品过滤头样品过滤头的类型：30 mm内径：适用于大进样量的过滤，材料有纤维素,醋酸纤维，聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。13 mm内径：适用于范围广的过滤，材料为纤维素。3 mm内径：适用于小进样量的过滤，处理样

20、品体积为7l。滤膜类型滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂；适用于水溶液。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。12、流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改

21、变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法有：常用的脱气方法有：氦气脱气法：利用氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相用超声波振荡10-15 min，此法效果最差。在线真空脱气法：利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。13、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞及堵塞后的处理、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞及堵塞后的处理 溶剂的污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或

22、磷酸盐缓冲液（pH=4-7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。A：严格执行溶剂过滤。B：勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠.D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气，隔绝空气。E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在硝酸（10%-35%）中浸泡1 h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。1实验目的；实验目的；实验内容；实验内容；实验要求。实验要求。11.实验目的实验目的 1、掌握高效液相色谱法（、掌握高效液相色谱法（HPLC）的基本）的基本原理和仪器结构；原理和仪器结构；2、熟悉、熟悉HPLC方法建立；方法建立；3、了解、了解HPLC的发展和应用趋势。的发展和应用趋势。12.实验内容实验内容 微波辅助萃取（微波辅助萃取（MAE）实际样品测定实际样品测定 Vc的标准曲线绘制的标准曲线绘制 12.实验要求实验要求 预习：回答预习：回答What?Why?How?What?Why?How?随机提问方式；随机提问方式；蔬果样品可自备；蔬果样品可自备；迟到必究；迟到必究；善始善终完成实验。善始善终完成实验。实验成绩：预习实验成绩：预习10%+实验实验40%+报告报告30%+考试考试20%1谢谢！