第八章-酶的固定化课件.ppt

1、1.不稳定：在高温、高压、强酸、强碱下易失活，不稳定：在高温、高压、强酸、强碱下易失活，即使在最适条件下反应；即使在最适条件下反应；2.回收困难，不能重复使用：经济上不合算；回收困难，不能重复使用：经济上不合算；3.反应速度减慢，不容易与毒副分子和产物分离。反应速度减慢，不容易与毒副分子和产物分离。游离酶的不足：游离酶的不足：什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固相酶、固定化酶）固定化技术 固定化酶固定化酶：固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。酶的固定化酶的固定化固定化酶的优点v增加酶稳定性，可反复或连续使用，提高使用效率，降低成本v易于和反应产物

2、分开，产物溶液无酶残留，简化提纯工艺v酶反应过程可严格控制v较游离酶更适合多酶反应v增加产物收率，提高产物质量5.1.1 酶的固定化方法酶的固定化方法微囊型微囊型固定化方法固定化方法吸附法吸附法结合法结合法交联法交联法包埋法包埋法网格型网格型共价键共价键结合法结合法离子键离子键结合法结合法 B.B.半透膜包埋法半透膜包埋法(微囊）微囊）：将酶或细胞包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微米几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。(适用于产物、底物分子量小的）适用于产物、底物分子量小的）常用载体常用载体半半透膜有：聚酰胺膜、透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜火棉胶膜 制备方法

3、：将酶液制备方法：将酶液滴分散在与水互不相滴分散在与水互不相溶的有机溶剂中，再溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半在酶液滴表面形成半透膜，将酶包埋在微透膜，将酶包埋在微胶囊之中胶囊之中。四、交联法：四、交联法：借助双功能试剂双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。u交联的形式：交联的形式：u （1）酶直接交联法）酶直接交联法u （2）酶与辅助蛋白交联法）酶与辅助蛋白交联法固定化固定化方法方法结合法结合法包埋法包埋法吸附法吸附法交联法交联法离子键离子键共价键共价键制备难易制备难易易难较难易较难结合程度结合程度中等强强弱强活力回收活力回收高低高高，酶易流失中等再

4、生再生可能不能不能可能不能固定化成本固定化成本低高低低中等底物专一性底物专一性不变可变不变不变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较各种酶固定化方法的比较方 法优 点缺 点吸附法制作条件温和、简便、成本低、载体再生、可反复使用结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小包埋法操作简单，固定化酶活力较高，适用性广。仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问题离子键结合法条件温和，操作简便，活力损失小，结合量大。由于离子键结合力弱，酶与载体之间结合不牢固，在pH、离子强度等条件改变时，酶易脱离。共价结合法载体与偶联方法可选择性大；酶的结合力强

5、，非常稳定偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶联试剂有一定毒性，制作较繁琐交联法可用的交联试剂多，技术简易，酶的结合力强，稳定性高，可长期使用反应条件较激烈，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。热处理法制作方便，酶活力高，稳定性高只适用于热稳定性好的酶5.1.3 固定化酶的特性固定化酶的特性（1）酶的活性）酶的活性：通常低于天然酶（有例外）。（2）酶的稳定性）酶的稳定性 酶的热稳定性、储存稳定性、操作稳定性以及对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。可能的原因：可能的原因：固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防

6、止酶分子伸展变形；变形；抑制酶的自身降解。抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。（3）酶的最适温度）酶的最适温度 最适温度变化不大。有些酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。（4）酶的最适）酶的最适pH a.载体性质的影响载体性质的影响 b.产物性质对最适产物性质对最适pH值的影响值的影响 带负电荷载体：产物为酸性：最适pH值高一些；最适pH 向碱性偏移。产物为碱性：最适pH值低一些；带正电荷载体：产物为中性：最适pH值一般不改。最适pH 向酸性偏移。（5）米氏常数）米氏常数 米氏常数Km反映了酶与底物的亲和力。使固定化酶

7、Km变动的原因，主要是由于载体与底物间静电相互作用。固定化载体与底物电荷相反，固定化酶的表观固定化载体与底物电荷相反，固定化酶的表观Km值降低。值降低。固定化载体与底物电荷相同，固定化酶的表观固定化载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km值显著增加。值显著增加。（6）底物特异性）底物特异性 v作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化v既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。1.同一批固定化酶能在工艺流程中同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次的使用重复多次的使用；2.易与底物、产物分开易与底物、产物分开有利于控制生产过程有利于控制生产过程；产物溶液；产物溶液中没有酶的残留，

8、中没有酶的残留，简化了提纯工艺简化了提纯工艺；3.在绝大多数情况下在绝大多数情况下提高了酶的稳定性提高了酶的稳定性；4.较能较能适应于多酶反应适应于多酶反应；5.提供了提供了研究酶动力学的良好模型研究酶动力学的良好模型。固定化酶的优点（与游离酶比较）：固定化酶的优点（与游离酶比较）：固定化酶的缺点：固定化酶的缺点：（1）酶固定化时酶固定化时酶的活力有所损失酶的活力有所损失。（2）增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。）增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。（3）比较适应水溶性底物和小分子底物。比较适应水溶性底物和小分子底物。（4）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅与完整细胞比较，不适

9、于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。5.2 细胞固定化细胞固定化 固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。繁殖、新陈代谢）的细胞。分类方式分类方式固定化细胞固定化细胞分类方式分类方式固定化细胞固定化细胞细胞类型细胞类型微生物微生物植物植物动物动物生理状态生理状态死细胞死细胞:完整细胞完整细胞,细胞碎片细胞碎片,细胞器细胞器活细胞活细胞:增殖细胞增殖细胞,静止细胞静止细胞,饥饿细胞饥饿细胞固定化细胞的分类固定化细胞的分类v原因之一

10、:细胞壁对物质扩散的障碍v原生质体微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后就可获得(1)保护了原生质体(2)利于氧的传递、营养成分的吸收和胞内产物的分泌v一般采用一般采用网格包埋法网格包埋法（即凝胶包埋法）。（即凝胶包埋法）。v常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。脂。v注意：注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。5.3 原生质体固定化原生质体固定化（二）固定化原生质体的特点v有利于胞内物质的分泌v稳定性好v有利于产物的分离纯化v需添加渗透压稳定剂1固定化酶在工业生产中的应用v现已

11、用于工业生产的固定化酶主要有：氨基酰化酶 葡萄糖异构酶天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶延胡索酸酶 半乳糖苷酶天门冬氨酸-脱羧酶脂肪酶植酸酶 5.5 固定化酶的应用固定化酶的应用18/1382.固定化酶在酶传感器方面的应用v酶传感器酶传感器是由是由固定化酶与能量转换器固定化酶与能量转换器（电极、场效应管、离（电极、场效应管、离子选择场效应管等）密切结合而成的传感装置，是生物传感子选择场效应管等）密切结合而成的传感装置，是生物传感器的一种。器的一种。v广泛用于临床诊断、工业发酵过程控制和环境监测等领域。生物传感器原理图本章重点v何谓固定化酶？何谓固定化酶？v酶的常见固定化方法有哪些？分别以什么为载体？酶的常见固定化方法有哪些？分别以什么为载体？如何操作？各自有何优缺点？如何操作？各自有何优缺点？v相对游离酶，固定化酶有何优缺点？经过固定化以相对游离酶，固定化酶有何优缺点？经过固定化以后酶的催化特性有何改变？后酶的催化特性有何改变？v固定化酶活测定的方法？固定化酶活测定的方法？v什么是固定化细胞和固定化原生质？什么是固定化细胞和固定化原生质？v固定化酶的应用固定化酶的应用