微生物学药学专业免疫学应用课件.pptx

1、微生物学药学专业免疫学应微生物学药学专业免疫学应用用第一节第一节 免疫学预防免疫学预防免疫免疫天然天然获得性获得性被动被动主动主动人工人工天然天然人工人工天然天然自然感染自然感染（隐性、显性）（隐性、显性）抗毒素抗毒素免疫球蛋白免疫球蛋白疫苗疫苗类毒素类毒素 来自母亲的抗体来自母亲的抗体（IgGIgG，sIgAsIgA）区别区别天然被动免疫天然被动免疫:母亲通过胎盘将母亲通过胎盘将IgGIgG、通过初乳将、通过初乳将IgAIgA传给婴儿。传给婴儿。一、人工主动免一、人工主动免疫疫u概念：概念：给机体输入抗原物质，使免疫系统因抗原的刺激，给机体输入抗原物质，使免疫系统因抗原的刺激，产生类似感染时

2、所发生的免疫过程，从而产生特异性免疫产生类似感染时所发生的免疫过程，从而产生特异性免疫力。力。u疫苗的概念：疫苗的概念：1.将细菌制作的人工主动免疫的生物制剂称为将细菌制作的人工主动免疫的生物制剂称为菌苗菌苗。2.将病毒、立克次体、螺旋体等制成的人工主动免疫的生将病毒、立克次体、螺旋体等制成的人工主动免疫的生物制剂称为物制剂称为疫苗疫苗。3.国际上将细菌制剂、病毒制剂以及类毒素统称为国际上将细菌制剂、病毒制剂以及类毒素统称为疫苗疫苗。抗原抗原(Ag)与T细胞结合，激活T细胞记忆记忆T细胞细胞活化的T杀伤细胞与B细胞结合，诱导B细胞释放抗体记忆记忆B细胞细胞活化的B细胞抗体免疫记忆免疫记忆AB白

3、喉疫苗白喉疫苗DE抗白喉抗体抗白喉抗体白喉白喉Bm cell抗白喉抗体抗白喉抗体白喉白喉 Bm cell活疫苗活疫苗死疫苗死疫苗类毒素类毒素 用于主动免疫的用于主动免疫的疫苗疫苗u活疫苗活疫苗：由由 减毒或无毒力的活病原微生物制减毒或无毒力的活病原微生物制成。成。常见种类：卡介苗、麻疹活疫苗、脊髓灰常见种类：卡介苗、麻疹活疫苗、脊髓灰质炎活疫苗。质炎活疫苗。u死疫苗：死疫苗：病原微生物经理化方法灭活制成。病原微生物经理化方法灭活制成。常见种类：伤寒、百日咳、霍乱、钩端螺旋体常见种类：伤寒、百日咳、霍乱、钩端螺旋体病、流感、狂犬病、乙型脑炎疫苗病、流感、狂犬病、乙型脑炎疫苗 活疫苗活疫苗与与死疫

4、苗的比较死疫苗的比较特点特点制剂特点制剂特点 接种剂量及次数接种剂量及次数恢复倾向恢复倾向无毒或减毒的活无毒或减毒的活微生物微生物量较小，一般仅需量较小，一般仅需要一次要一次 相对稳定性相对稳定性不稳定不稳定可以回复为毒株可以回复为毒株强毒死微生物强毒死微生物量较大，需要多量较大，需要多次接种次接种较稳定较稳定不回复为毒株不回复为毒株免疫效果免疫效果较好，维持较好，维持3-53-5年甚年甚至更长至更长较差，维持半年至较差，维持半年至一年一年活疫苗活疫苗死疫苗死疫苗诱导的免疫类型诱导的免疫类型体液免疫和细胞体液免疫和细胞免疫免疫体液免疫为主体液免疫为主活疫苗活疫苗病毒疫苗病毒疫苗脊髓灰质炎脊髓灰

5、质炎,麻疹麻疹,腮腺炎腮腺炎,风风疹疹,鸡水痘鸡水痘,甲肝甲肝,黄热病。黄热病。结核结核(BCG).活菌疫苗（唯一）活菌疫苗（唯一）死病毒疫苗死病毒疫苗(加热加热,化学化学或紫外光照射或紫外光照射)流感流感,狂犬病狂犬病 伤寒伤寒,霍乱霍乱,百日咳百日咳etc.死疫苗死疫苗死菌疫苗死菌疫苗（大多数细菌）（大多数细菌）常见的疫苗常见的疫苗类毒素类毒素 概念：概念：种类：种类：新型疫苗新型疫苗u1.1.亚单位疫苗：亚单位疫苗：脑膜炎球菌脑膜炎球菌u2.2.合成肽疫苗合成肽疫苗 u3.3.基因工程疫苗基因工程疫苗 重组乙型肝炎病毒表面抗原重组乙型肝炎病毒表面抗原 二、人工被动免疫二、人工被动免疫将一

6、个免疫了的供体的血清或免疫球蛋白转入到将一个免疫了的供体的血清或免疫球蛋白转入到一个未免疫的个体一个未免疫的个体.没有抗原刺没有抗原刺激免疫系统激免疫系统免疫免疫细胞细胞免疫血清免疫血清u概念：概念：是指用免疫动物后获得的免疫血清或从机体组是指用免疫动物后获得的免疫血清或从机体组织中提取制成的免疫球蛋白，主要成分为抗体。织中提取制成的免疫球蛋白，主要成分为抗体。u常用的种类有：常用的种类有：（一）抗毒素血清（一）抗毒素血清 （二）胎盘丙种球蛋白和人血清丙种球蛋白（二）胎盘丙种球蛋白和人血清丙种球蛋白（三）抗菌免疫血清（三）抗菌免疫血清（四）抗病毒免疫血清（四）抗病毒免疫血清（五）抗淋巴细胞丙种

7、球蛋白（五）抗淋巴细胞丙种球蛋白破伤风抗毒素(马血清)异源异源 同源同源人工注射人的人工注射人的 球蛋白或免疫动物的球蛋白或免疫动物的 球蛋白。球蛋白。马血清马血清抗毒素的两重性：2 2、异种抗原，可刺激机体产生抗马血清、异种抗原，可刺激机体产生抗马血清抗体，或超敏反应（抗体，或超敏反应（I I，IIIIII）。）。1 1、特异性抗体、特异性抗体-中和毒素中和毒素人工主动免疫与人工被动免疫人工主动免疫与人工被动免疫区别点区别点人工主动免疫人工主动免疫人工被动免疫人工被动免疫接种物接种物抗原抗原抗体抗体免疫力出现时间免疫力出现时间慢，要经过慢，要经过1-4周周诱导期诱导期快，即刻产生快，即刻产生

8、免疫力维持时间免疫力维持时间长（数月长（数月-数年）数年）较短（较短（2周周-数周）数周）用途用途预防预防治疗或紧急预治疗或紧急预防防免疫学治疗第二节第二节（一）免疫增强剂（一）免疫增强剂u概念：概念：是增强、促进和调节机体免疫功能的生物制剂或是增强、促进和调节机体免疫功能的生物制剂或非生物制剂。非生物制剂。u常见种类：常见种类：免疫因子免疫因子 微生物制剂微生物制剂 化学药物化学药物 中药制剂中药制剂u常用来常用来治疗免疫缺陷、病毒感染性疾病和肿瘤。治疗免疫缺陷、病毒感染性疾病和肿瘤。细胞因子细胞因子u细胞因子作为一类重要和有效的生物反应调节剂，正细胞因子作为一类重要和有效的生物反应调节剂，

9、正逐渐称为一种常规手段应用于免疫治疗。逐渐称为一种常规手段应用于免疫治疗。u目前已在临床得到应用的细胞因子包括目前已在临床得到应用的细胞因子包括ILIL、IFNIFN、CSFCSF、TNFTNF等。等。u它们主要用于免疫缺陷、自身免疫、病毒感染性疾病它们主要用于免疫缺陷、自身免疫、病毒感染性疾病和肿瘤的治疗。和肿瘤的治疗。过继免疫过继免疫u过继免疫治疗：过继免疫治疗：过继免疫是将对疾病有免疫力过继免疫是将对疾病有免疫力的供者的免疫应答产物转移给其他个体，或自的供者的免疫应答产物转移给其他个体，或自体的细胞经体外处理后回输自身，以发挥治疗体的细胞经体外处理后回输自身，以发挥治疗疾病的作用。疾病的

10、作用。u用于过继免疫的物质：用于过继免疫的物质：包括免疫血清、免疫细包括免疫血清、免疫细胞、细胞因子如转移因子、免疫核糖核酸等。胞、细胞因子如转移因子、免疫核糖核酸等。骨髓干细胞移植骨髓干细胞移植u概念：概念：是取患者或健康人的骨髓回输给患者，让骨髓是取患者或健康人的骨髓回输给患者，让骨髓中的干细胞进入患者体内定居、分化、增殖，使患者中的干细胞进入患者体内定居、分化、增殖，使患者恢复造血功能和免疫力。恢复造血功能和免疫力。u类型：类型：1.1.自体骨髓干细胞移植自体骨髓干细胞移植 2.2.异体骨髓干细胞移植异体骨髓干细胞移植 3.3.脐血干细胞移植脐血干细胞移植u应用：应用：1.1.免疫缺陷病

11、免疫缺陷病 2.2.再生障碍性贫血再生障碍性贫血 3.3.白血病白血病（二）免疫抑制剂（二）免疫抑制剂u概念：概念：是一类抑制机体免疫功能的生物制剂或非生物制剂。是一类抑制机体免疫功能的生物制剂或非生物制剂。u常见种类：常见种类：1.1.真菌代谢产物真菌代谢产物 2.McAb 2.McAb 3.3.抗肿瘤药物抗肿瘤药物 4.4.中药制剂中药制剂 5.5.激素激素u特点：特点：1.1.作用是非特异性作用是非特异性 2.2.大多有毒副作用大多有毒副作用治疗性疫苗治疗性疫苗u概念：概念：是以抗原为治疗剂，用特定的抗原成分制成的是以抗原为治疗剂，用特定的抗原成分制成的疫苗。进入机体后可增强免疫应答或诱

12、导免疫耐受，疫苗。进入机体后可增强免疫应答或诱导免疫耐受，从而达到治疗疾病的目的。从而达到治疗疾病的目的。u用途：用途：1.1.增强免疫应答的疫苗：增强免疫应答的疫苗：治疗感染和肿瘤。治疗感染和肿瘤。2.2.诱导免疫耐受的疫苗：诱导免疫耐受的疫苗：治疗自身免疫病和超敏反治疗自身免疫病和超敏反应，防止免疫排斥。应，防止免疫排斥。第三节第三节 免疫学诊断免疫学诊断 一、体液免疫测定法一、体液免疫测定法（一）抗原抗体反应的原理和特点（一）抗原抗体反应的原理和特点 原理：原理：抗原决定簇与抗体的抗原结合部位间存抗原决定簇与抗体的抗原结合部位间存在结构的互补性，二者相互结合，在适宜条件在结构的互补性，二

13、者相互结合，在适宜条件下，出现可见反应。下，出现可见反应。原则：原则：用已知抗体检测未知抗原，也可用已知用已知抗体检测未知抗原，也可用已知抗原检测未知抗体。抗原检测未知抗体。特点：特点：1.1.特异性特异性 2.2.可见性可见性 3.3.可逆性可逆性1.1.特异性特异性 一种抗原一般仅能与由它刺激所产生的抗体一种抗原一般仅能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原结合，这种抗原-抗体结合反应的专一性即特抗体结合反应的专一性即特异性。异性。2.2.可见性可见性u若抗原、抗体的数量比例恰当，抗体分子的两个若抗原、抗体的数量比例恰当，抗体分子的两个FabFab段分别与两个抗原分子结合，相互交叉连接成网格

14、状段分别与两个抗原分子结合，相互交叉连接成网格状复合体，反应体系中基本无游离的抗原或抗体。此时，复合体，反应体系中基本无游离的抗原或抗体。此时，可形成肉眼可见的明显反应物（沉淀物或凝集物）。可形成肉眼可见的明显反应物（沉淀物或凝集物）。u因此，确定抗原、抗体的最适比例十分重要，应根据因此，确定抗原、抗体的最适比例十分重要，应根据抗原的物理性状，对抗原或抗体进行稀释，以确定最抗原的物理性状，对抗原或抗体进行稀释，以确定最适比例。适比例。3.3.可逆性可逆性u抗原与抗体的结合为分子表面的非共价结合，结合稳抗原与抗体的结合为分子表面的非共价结合，结合稳定且可逆。定且可逆。u在一定条件下，抗原抗体结合

15、形成的复合物可被解离，在一定条件下，抗原抗体结合形成的复合物可被解离，如低如低pHpH、高浓度盐、冻融等。、高浓度盐、冻融等。u解离后的抗原或抗体分子仍保持原有的理化特性和生解离后的抗原或抗体分子仍保持原有的理化特性和生物学活性。如解离后的外毒素恢复其毒性，细菌仍可物学活性。如解离后的外毒素恢复其毒性，细菌仍可存活。存活。（二）抗原或抗体的检测方法（二）抗原或抗体的检测方法u 根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分因素，可将抗原抗体反应分为：应的成分因素，可将抗原抗体反应分为：凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应补体参与的反应补体参与的反应采用标记物的

16、抗原抗体反应采用标记物的抗原抗体反应1.1.凝集反应凝集反应概念：概念：细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，此类反应抗体结合后形成凝集团块，此类反应称为凝集反应。称为凝集反应。方法：方法：（1 1）直接凝集）直接凝集 （2 2）间接凝集）间接凝集（1 1）直接凝集直接凝集 将细菌或红细胞与相应抗体直接反应，出现细将细菌或红细胞与相应抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。菌凝集或红细胞凝集现象。玻片法：玻片法：是用已知抗体与相应抗原在玻片上反是用已知抗体与相应抗原在玻片上反应，用于抗原的应，用于抗原的定性检测定性检测，如，如ABOABO血型鉴

17、定、血型鉴定、细菌鉴定。细菌鉴定。试管法：试管法：是在试管中连续稀释待检血清，加入是在试管中连续稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原，用于抗体的已知颗粒性抗原，用于抗体的定量检测定量检测，如诊，如诊断伤寒病的肥达试验。断伤寒病的肥达试验。（2 2）间接凝集）间接凝集 概念概念：将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应，出现颗粒物凝颗粒表面，再与相应抗体反应，出现颗粒物凝集的现象。集的现象。常用的载体：常用的载体：人人O O型血红细胞型血红细胞 聚苯乙烯乳胶颗粒聚苯乙烯乳胶颗粒 反应的类型：反应的类型：间接凝集反应的类型间接凝集反应的类型 根据致

18、敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式，根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式，间接凝集反应可分为：间接凝集反应可分为：（正向）间接凝集反应：（正向）间接凝集反应：用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。反向间接凝集反应：反向间接凝集反应：用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。间接凝集抑制反应间接凝集抑制反应 间接凝集抑制反应间接凝集抑制反应 诊断试剂：诊断试剂：为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。于检测标本中是否存在与致

19、敏抗原相同的抗原。检测方法：检测方法：为将标本先与抗体试剂作用，然后再加入为将标本先与抗体试剂作用，然后再加入致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在相致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原，则凝集反应被抑制。起作用。如标本中存在相同抗原，则凝集反应被抑制。2 2、沉淀反应、沉淀反应 概念：概念：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，此后出现沉淀物，此类反应称为沉淀反应。类

20、反应称为沉淀反应。方法：方法：沉淀反应多用沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散。即可溶性抗原与抗进行琼脂扩散或免疫扩散。即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇时形成可体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇时形成可见的见的白色沉淀白色沉淀。（1 1）单向琼脂扩散单向琼脂扩散u方法：方法：将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。u结果：结果：抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的

21、沉淀环，环的直径与抗原含量呈正相关。抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量呈正相关。取已知量抗原绘制标准曲线，可根据所形成沉淀环的直取已知量抗原绘制标准曲线，可根据所形成沉淀环的直径，从标准曲线中查出待检标本的抗原含量。径，从标准曲线中查出待检标本的抗原含量。u应用：应用：本法常用于定量测定血清本法常用于定量测定血清IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA和和C3C3等。等。（2 2）双向免疫扩散双向免疫扩散u将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶的小孔中，二将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。u若反应体系中含两种以上抗原

22、若反应体系中含两种以上抗原-抗体系统，则抗体系统，则小孔间可出现两条以上沉淀线。小孔间可出现两条以上沉淀线。u本法常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两本法常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原的相关性分析。种抗原的相关性分析。（3 3）免疫电泳）免疫电泳 方法：方法：先将待检血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各先将待检血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组份被分为不同区带，然后按电泳方向平行挖一蛋白组份被分为不同区带，然后按电泳方向平行挖一小槽，加入相应抗血清，与已分成区带的蛋白抗原成小槽，加入相应抗血清，与已分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应位置形成沉淀弧。分作双向免疫扩散，

23、在各区带相应位置形成沉淀弧。结果：结果：对照正常血清形成的沉淀弧数量、位置和形态，对照正常血清形成的沉淀弧数量、位置和形态，可分析标本中所含抗原成分的性质和含量。可分析标本中所含抗原成分的性质和含量。应用：应用：该法常用于血清蛋白种类分析，以观察该法常用于血清蛋白种类分析，以观察IgIg异常异常增多或缺失，可诊断骨髓瘤及性联低丙种球蛋白血症增多或缺失，可诊断骨髓瘤及性联低丙种球蛋白血症等疾病。等疾病。（4 4）免疫比浊）免疫比浊 方法：方法：在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成免疫复合物，液体混浊。定时间形成免疫复合物，液体混浊。结果：结果

24、：用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多则浊度越高，可绘制标准曲线并依据反应液体的浊多则浊度越高，可绘制标准曲线并依据反应液体的浊度推算样品中抗原含量。度推算样品中抗原含量。应用：应用：该法快速简便，可取代单向免疫扩散用于测定该法快速简便，可取代单向免疫扩散用于测定IgIg含量。含量。3.3.免疫标记技术免疫标记技术u概念：概念：免疫标记技术乃用荧光素、酶或放射性核素等免疫标记技术乃用荧光素、酶或放射性核素等标记抗体或抗原，进行抗原标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应。抗体反应。u标记物与抗体或抗原连接后并不改变后者的免疫特性。标记物与抗体或抗原连接后

25、并不改变后者的免疫特性。u优点：优点：具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。优点。是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。（1 1）免疫荧光法）免疫荧光法(IF)(IF)概念：概念：用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复抗体复合物散发荧光，借此鉴定或定位标本中的抗原。合物散发荧光，借此鉴定或定位标本中的抗原。常用的荧光素：常用的荧光素：有异硫氰酸荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)(FITC)

26、和藻红蛋白和藻红蛋白（PEPE），前者发黄绿色荧光，后者发红色荧光。），前者发黄绿色荧光，后者发红色荧光。方法：方法：直接荧光法直接荧光法 方法：方法：将荧光素直接标记抗体，对标本进行染色。将荧光素直接标记抗体，对标本进行染色。优点：优点：是特异性高。是特异性高。缺点：缺点：是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。间接荧光法间接荧光法 方法：方法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。标记的二抗染色。优点：优点：是敏感度比直接法高，制备一种荧光素是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检查，但非

27、特标记的二抗即可用于多种抗原的检查，但非特异性反应亦增加。异性反应亦增加。免疫荧光法的应用免疫荧光法的应用u检查细菌、病毒、螺旋体等抗原或抗体，用于检查细菌、病毒、螺旋体等抗原或抗体，用于诊断传染病。诊断传染病。u鉴定免疫细胞表面的鉴定免疫细胞表面的CDCD分子。分子。u检测自身免疫病的抗核抗体。检测自身免疫病的抗核抗体。（2 2）酶免疫测定）酶免疫测定(EIA)(EIA)方法：方法：将抗原将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。结果观察：结果观察：可用目测定性，

28、也可用酶标测定仪测定光密可用目测定性，也可用酶标测定仪测定光密度（度（ODOD）值以反映抗原含量，灵敏度可达每毫升）值以反映抗原含量，灵敏度可达每毫升ngng甚至甚至pgpg水平。水平。常用于标记的酶：常用于标记的酶：有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。常用的方法：常用的方法：酶联免疫吸附试验：测定可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：测定可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法：检测组织或细胞表面抗原酶免疫组化法：检测组织或细胞表面抗原酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA)u是酶免疫测定中应用最广的技术。是酶免疫测定中应用最广的技术。u基本方法是：基本方法

29、是：将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原苯乙烯微量反应板）表面，使抗原-抗体反应在固相表抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将固相上的抗原面进行，用洗涤法将固相上的抗原-抗体复合物与液相抗体复合物与液相中的游离成份分开。中的游离成份分开。uELISAELISA的操作方法很多，简介以下方法：的操作方法很多，简介以下方法：双抗体夹心法双抗体夹心法 间接法间接法双抗体夹心法双抗体夹心法u用于检查特异性抗原。用于检查特异性抗原。u方法：方法：将已知抗体包被固相，加入待检标本，标本中将已知抗体包被固相，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相表

30、面的抗体结合，洗涤去除若含有相应抗原即与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。若标本中无相应结合的酶标记抗体，加底物后显色。若标本中无相应抗原，固相表面即无抗原结合，加入的酶标记抗体则抗原，固相表面即无抗原结合，加入的酶标记抗体则不能结合于固相并被洗涤去除，当加入无色底物后，不能结合于固相并被洗涤去除，当加入无色底物后，因无酶催化故不显色。因无酶催化故不显色。间接法间接法u用于检查特异性抗体。用于检查特异性抗体。u方法：方法：用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再用已知抗原包被固

31、相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。ELISAELISA敏感性高、操作简便，配套仪器设备的发展使敏感性高、操作简便，配套仪器设备的发展使操作程序规范化和自动化，并进一步提高了稳定性，操作程序规范化和自动化，并进一步提高了稳定性，被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其它被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其它体液中微量蛋白成分、细胞因子等。体液中微量蛋白成分、细胞因子等。免疫组化技术免疫组化技术u概念：概念：是应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，是应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对抗原作定性、定量

32、、定位检测。结合形态学观察，对抗原作定性、定量、定位检测。u常用的技术包括：常用的技术包括：酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）免疫金组化（胶体金颗粒标记）免疫金组化（胶体金颗粒标记）免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记）免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记）（3 3）放射免疫测定法）放射免疫测定法(RIA)(RIA)u概念：概念：用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。u它将放射性核素具有的高灵敏度和抗原它将放射性核素具有的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性抗体反应的特异性相结合，使检测的灵敏度达相结合，使

33、检测的灵敏度达pgpg水平。水平。u常用于标记的放射性核素有：常用于标记的放射性核素有：125I125I和和131I131I。u采用的方法分为：采用的方法分为：液相法和固相法两种。液相法和固相法两种。u应用：应用：常用于常用于测定微量物质测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛等药物，以及腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛等药物，以及IgEIgE等。等。二、细胞免疫测定法二、细胞免疫测定法u检测淋巴细胞的类别、数量与功能，是判断机检测淋巴细胞的类别、数量与功能，是判断机体免疫功能状态的重要手段。体免疫功能状态的重要手段。u患者外周血是主要的标本

34、来源，但仅代表再循患者外周血是主要的标本来源，但仅代表再循环的淋巴细胞。环的淋巴细胞。u实验动物还可取胸腺、脾脏、淋巴结等作为标实验动物还可取胸腺、脾脏、淋巴结等作为标本进行检查。本进行检查。（一）体外测定法（一）体外测定法 1.1.E E花结试验：花结试验：人成熟人成熟T T细胞表面细胞表面CD2CD2分子是绵羊红细胞（分子是绵羊红细胞（SRBCSRBC）受体，能结合受体，能结合SRBCSRBC而形成花结。而形成花结。2.T2.T细胞增殖试验细胞增殖试验u原理：原理：植物血凝素（植物血凝素（PHAPHA）、刀豆蛋白）、刀豆蛋白A A（Con ACon A）等丝）等丝裂原以及抗裂原以及抗CD3

35、CD3抗体等均能非特异性激活培养的抗体等均能非特异性激活培养的T T细胞，细胞，使其转化为淋巴母细胞。在增殖过程中，细胞使其转化为淋巴母细胞。在增殖过程中，细胞DNADNA、RNARNA、蛋白质合成增加，细胞形态发生改变，最终细胞、蛋白质合成增加，细胞形态发生改变，最终细胞分裂。分裂。u方法：方法：3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法u方法：方法：在外周血单个核细胞（在外周血单个核细胞（PBMCPBMC）中加入）中加入PHAPHA共同共同培养，终止培养前培养，终止培养前8-158-15小时加入氚标记的胸腺嘧啶核小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（苷（3H-TdR3

36、H-TdR），由于），由于3H-TdR3H-TdR能掺入细胞合成的能掺入细胞合成的DNADNA中，中，故细胞增殖水平越高，掺入的放射性核素亦越多。培故细胞增殖水平越高，掺入的放射性核素亦越多。培养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样品的放射活养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样品的放射活性，可反映细胞的增殖状况。性，可反映细胞的增殖状况。u特点：特点：该法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，易该法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，易发生放射性污染。发生放射性污染。3.T3.T细胞亚群测定法细胞亚群测定法 用间接用间接免疫免疫荧光法检测淋巴细胞表面标志或鉴荧光法检测淋巴细胞表面标志或鉴定细胞亚群。定

37、细胞亚群。4.4.细胞因子检测细胞因子检测u应用：应用：了解其免疫调节作用；鉴定分离的淋巴细胞；了解其免疫调节作用；鉴定分离的淋巴细胞；监测某些疾病状态的细胞免疫功能。监测某些疾病状态的细胞免疫功能。u检测方法包括以下三种：检测方法包括以下三种：（1 1）ELISA ELISA （2 2）生物活性测定法）生物活性测定法 （3 3）聚合酶链反应（）聚合酶链反应（PCRPCR）（1 1）ELISAELISAu用抗细胞因子抗体包被固相的双抗体夹心法，用抗细胞因子抗体包被固相的双抗体夹心法，也可使用也可使用RIARIA法。法。u此法可用于检测此法可用于检测IL-2IL-2、IL-5IL-5、IL-6I

38、L-6等。等。（2 2）生物活性测定法）生物活性测定法u根据细胞因子生物学活性选用相应实验系统，包括细根据细胞因子生物学活性选用相应实验系统，包括细胞增殖法、直接杀伤法、保护细胞免受病毒致病变法胞增殖法、直接杀伤法、保护细胞免受病毒致病变法等。等。u细胞增殖法：细胞增殖法：如选用细胞因子依赖的细胞株，其增殖如选用细胞因子依赖的细胞株，其增殖反应与细胞因子量呈正相关，通过与相应标准品比较，反应与细胞因子量呈正相关，通过与相应标准品比较，可确定样品中细胞因子（如可确定样品中细胞因子（如IL-1IL-1、IL-2IL-2、IL-4IL-4、IL-6IL-6）含量。含量。（3 3）聚合酶链反应（）聚合

39、酶链反应（PCRPCR）u根据细胞因子的核苷酸序列，设计相应细胞因根据细胞因子的核苷酸序列，设计相应细胞因子的引物，借助逆转录子的引物，借助逆转录PCRPCR测定待检细胞中特测定待检细胞中特异性异性mRNAmRNA。u该法可用于多种细胞因子的检定。该法可用于多种细胞因子的检定。（二）（二）体外测定法体外测定法皮肤试验皮肤试验u原理：原理：正常机体对特定抗原产生细胞免疫应答后，再正常机体对特定抗原产生细胞免疫应答后，再用相同抗原作皮肤试验，即出现以局部红肿为特征的用相同抗原作皮肤试验，即出现以局部红肿为特征的迟发型超敏反应，迟发型超敏反应，细胞免疫正常者呈阳性反应，而细细胞免疫正常者呈阳性反应，而细胞免疫低下者则呈阴性反应。胞免疫低下者则呈阴性反应。u皮肤试验方法简便，可帮助诊断某些病原微生物感染皮肤试验方法简便，可帮助诊断某些病原微生物感染（结核杆菌、麻风杆菌）、免疫缺陷病等。（结核杆菌、麻风杆菌）、免疫缺陷病等。u皮肤试验常用的生物性抗原多从病原体中提取，如结皮肤试验常用的生物性抗原多从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素、链激酶核菌素、麻风菌素、链激酶-链道酶、念珠菌素、腮腺链道酶、念珠菌素、腮腺炎病毒等。炎病毒等。