抗核抗体谱免疫印迹法课件.ppt

1、抗核抗体谱检测及其临床意义课程章节单击添加文本 抗核抗体谱的定义1单击添加文本 自身免疫性疾病与ANAs的相关性2抗核抗体谱的免疫印迹法原理抗核抗体谱的临床意义抗核抗体谱的检测及意义3抗核抗体谱的定义第一章单击添加文本 抗核抗体谱的定义1抗核抗体谱的定义传统定义：针对细胞核成分的自身抗体的总称。多核苷酸：dsDNA，ssDNA，RNA组蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4,H2A-H2B复合体核浆中的核糖核蛋白（ENA）：Sm,nRNP,SSA/Ro,SSB/La核仁抗原：U3-nRNP/Fibrillaria，PM-Scl/PM-1，7-2-RNP/To，4-6-S-RNA着丝点：着丝点蛋

2、白其他蛋白：Scl-70,PCNA，核点,Mi-1,Mi-2,Ku，板层素，NOR-90根据细胞核内靶抗原分子理化特性和分布部位分类：抗核抗体谱的定义广义定义：指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸（nucleic acid）和核蛋白（nucleoprotein）抗体的总称。整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。自身免疫性疾病与ANAs的相关性第二章单击添加文本 自身免疫性疾病与ANAs的相关性2慢性炎症性结缔组织病 干燥综合征(SS)SS-A and SS-B慢性炎症性结缔组织病慢性炎症性结缔组织病 (CICTD)夏普综合

3、征(MCTD)nRNP系统性红斑狼疮(SLE)dsDNA慢性炎症性结缔组织病(CICTD)系统性硬化症(SSc)Scl-70 and CenpB多肌炎/皮肌炎(PM/DM)Myositis ProfileANCA相关性血管炎系统性红斑狼疮（SLE）统性红斑狼疮（SLE）是一种多发于青年女性的累及多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织病，早期、轻型和不典型的病例日渐增多。有些重症患者（除患者有弥漫性增生性肾小球肾炎者外），有时亦可自行缓解。有些患者呈“一过性”发作，经过数月的短暂病程后疾病可完全消失。系统性红斑狼疮（SLE）关节炎(至少2个关节以上受累;96%)血液系统受累(贫血等;60%)狼疮肾炎(

4、51%)浆膜炎(胸膜炎,心包炎;77%)神经系统受累(30%)皮肤(蝴蝶状皮疹,盘状狼疮;74%)SLE在临床上各器官受累的表现在临床上各器官受累的表现ANAs与系统性红斑狼疮（SLE）的相关性系统性红斑狼疮（SLE）中的自身抗体抗原阳性率双链DNA60-90%单链DNA70-95%RNA50%组蛋白95%U1-nRNP15-40%Sm5-40%SS-A（Ro）20-60%SS-B（La）10-20%细胞周期蛋白（PCNA）3%Ku10%核糖体P蛋白（rRNP）10%热休克蛋白90kDA：Hsp-9050%心磷脂40-60%类风湿关节炎（RA）类风湿关节炎（RA）是一种病因未明的慢性、以炎性滑

5、膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。ANAs与类风湿关节炎（RA）的相关性类风湿关节炎中的抗核抗体抗原阳性率组蛋白15-50%单链DNA（ssDNA）8%U1-nRNP3%RANA90-95%干燥综合征（SS）腮腺肿胀口腔干燥外分泌腺受累的自身免疫疾病症状:-口腔干燥 -唾液及眼泪减少 -腮腺肿胀 -胰腺外分泌腺分泌不足ANAs与干燥综合征（SS）的相关性原发性干燥综合征中的自身抗体抗原阳性率SS-A（Ro）40-95%SS-B（La）40-95%单链DNA（ss-DNA）13%RA

6、NA70%唾液腺分泌管40-60%类风湿因子60-80%多发性肌炎（PM）及皮肌炎（DM）皮肤与肌肉受累的自身免疫疾病症状:-肌肉疼痛/肌无力(如：肩膀/骨盆)皮肤症状:-膝盖/手指关节处皮肤异变-红斑-皮肤褪色ANAs与多发性肌炎（PM）及皮肌炎（DM）的相关性多肌炎和皮肌炎抗原阳性率PM-Scl（PM-1）50-70%Jo-1（组氨酰-tRNA合成酶）25-35%Mi-110%Mi-25%Ku50%单链AND（ss-DNA）40-50%PL-7（苏氨酰-tRNA合成酶）4%PL-12（丙氨酰-tRNA合成酶）3%进行性系统性硬化症（SSc）指端硬化，爪型手面具脸毛细血管扩张 皮肤钙质沉着

7、血管与结缔组织受累的自身免疫疾病 症状:-指端硬化(thin,sclerotic fingers)-爪型手-面具脸(嘴周边出现皱纹,嘴唇变薄)-毛细血管扩张(表面血管永久性扩张)-表皮钙质沉着(血管壁与皮肤钙化)ANAs与进行性系统性硬化症（SSc）的相关性弥漫性进行性系统性硬化症（DSSC）抗原阳性率原纤维蛋白5-10%PM-Scl（PM-1）50-70%Scl-7025-75%RNA多聚酶4%7-2-RNP（To）罕见NOR-90（核仁形成区）罕见局限性进行性系统性硬化症（LSSC）抗原阳性率着丝点80-95%抗核抗体谱的检测及意义第三章抗核抗体谱的免疫印迹法原理抗核抗体谱的临床意义抗核抗

8、体谱的检测及意义3抗核抗体谱的免疫印迹法原理u 抗核抗体谱的检测采用免疫印迹法（Immunoblotting Test,IBT）,用于定性检测人血清u 中抗核抗体谱共15中抗体。u 条膜上平行包被了经纯化的抗核抗体谱中要检测的抗原及质控带。u 第一次孵育时，已稀释的病人样本与膜条上的抗原反应。如果样本阳性，特异性的IgG抗体将与相应的抗原结合。为检测已结合的抗体，在加入酶标羊抗人IgG（碱性磷酸酶结合物）u 第二次孵育，然后加入底物液以产生蓝紫色颜色反应。抗核抗体谱的免疫印迹法原理抗U1-nRNP与Sm抗体u靶抗原：位于细胞核内的一组含尿嘧啶丰富的核糖核蛋白，Sm和U1RNP是同一分子复合物中

9、的不同位点。uSm含有u1、u2和u4-u6，而nRNP(u1RNP)仅含u1RNA。也即抗Sm抗体阳性均伴有抗u1RNP抗体，而抗u1RNP抗体可以单独存在。抗U1-nRNP与Sm抗体 u 抗Sm：SLE的标记性抗体，是前瞻性及回顾性诊断的指标。阳性率低：SLE（30%）u 抗U1RNP：多种CTD均可出现，与手指肿胀、雷诺现象、肌炎、指端硬化等相关，但肾炎发生率低。阳性率：40-60%，其中SLE(30-40%),SSc(14%),pSS(12%),PM/DM(15%)u 高滴度抗U1RNP+抗Sm-MCTDu 抗U1RNP+抗Sm+SLEu 抗U1RNP-抗Sm+实验室误差?U1RNP丢

10、失?抗SS-A/Ro-52抗体RNA+SS-A(60 kDa)hY-RNAhY-RNARNA+SS-A(60 kDa)+Ro-52Boire et al.,1995:-Ro-52抗体不与SS-A 抗原结合 -纯化的 SS-A 抗原不包含 Ro-52抗SS-A/Ro-52抗体抗抗SS-A(60 kDa)和抗和抗Ro-52 总是分开检测总是分开检测!WHY？抗SS-A/Ro-52抗体-天然天然 SS-A=RNA+SS-A 60 kDa 蛋白质蛋白质 无需无需 Ro-52。-Ro-52 并非并非 SLE 或或 SS 患者诊断所需抗体。患者诊断所需抗体。-SS-A 60和和 Ro-52抗原的混合包被会

11、降低抗原的混合包被会降低SSA抗体的疾病特异性。抗体的疾病特异性。-欧蒙产品始终分别检测欧蒙产品始终分别检测 SS-A 60 和和Ro-52。抗SS-A/Ro-52抗体抗Ro-52抗体:不同组别中均可出现抗SS-B抗体 u在原发性SS病人中，抗SSA/Ro和抗SSB/La阳性率分别为60%和40%，它们是诊断干燥综合征的血清学标志。u抗SSB抗体较抗SSA抗体诊断干燥综合征更为特异。u免疫扩散法与免疫印迹法（Western Blot）得出的结果常常不一致。uSSA和抗SSB抗体阳性可造成新生儿狼疮及婴儿心脏传导阻滞等先天性心脏病。u抗SSA和抗SSB抗体常与血管炎、淋巴结肿大、白细胞减少、光过

12、敏、皮损、紫癜等临床症状相关。抗SS-A抗体 and 抗SS-B抗体SS-A(Ro-60),Ro-52 and SS-B功能:RNA聚合酶III辅助蛋白抗SS-B抗体干燥综合症:SLE:新生儿狼疮:40-95%10-20%78%功能:调控RNA翻译X抗SS-A(60 kDa)抗体干燥综合症:SLE:新生儿狼疮:40-95%20-60%96%抗Ro-52(52 kDa)抗体非特异抗Scl-70抗体u靶抗原：靶抗原：DNA拓朴异构酶拓朴异构酶I的降解产物的降解产物主要存在主要存在核仁核仁中。中。uSSc的的标记抗体，标记抗体，阳性率阳性率20-30%。u多见于多见于DSSc（弥漫型系统性硬化症），

13、（弥漫型系统性硬化症），病情进展快，提示病情进展快，提示预后不良预后不良。u与与ILD（肺动脉高压）（肺动脉高压）、弥漫性皮肤弥漫性皮肤硬化硬化有关，而有关，而PAH（间质性肺病间质性肺病）少见。）少见。抗PM-Scl抗体u常见于多肌炎与硬化症的重叠症状中，在重叠症状中的阳性率为50%；也可以仅出现于多肌炎患者中，阳性率为8%,弥散性硬化症中的阳性率为2%-5%。抗Jo-1抗体靶抗原：组氨酸tRNA合成酶 胞浆中的磷酸蛋白抗Jo-1抗体uPM/DM的的标记抗体标记抗体，阳性率，阳性率20-30%u抗体效价与抗体效价与疾病活动性疾病活动性相关相关u抗抗Jo-1抗体综合征：急性发热抗体综合征：急性

14、发热,对称性关节炎对称性关节炎,技工手技工手,雷雷诺现象诺现象,肌炎（相对轻）肌炎（相对轻）,肺间质病变肺间质病变 u其他抗合成酶抗体：抗其他抗合成酶抗体：抗PL-7、抗、抗PL-12、抗、抗OJ、抗、抗EJ面具脸毛细血管扩张 皮肤钙质沉着抗CENP-B抗体u主要靶抗原：着丝点蛋白-Bu多见于LSSc，病程缓慢，提示预后较好。uCREST综合征：软组织钙化（C）,雷诺现象（R）,食道功能障碍（E）,指端硬化（S）,毛细血管扩张（T），但并非标记抗体，也见于孤立性雷诺现象、SS、PBC、AIH等。u国外文献：与PAH相关，而ILD少见 中国人群：未发现与PAH（肺动脉高压）相关，但ILD（间质性

15、肺疾病）少见白伊娜，王迁等.中国系统性硬化症患者硬皮病相关自身抗体的检测及其临床意义.中华微生物学和免疫学杂志.2011（5）:452-455.抗PCNA抗体抗增殖细胞核抗原抗体（抗增殖细胞核抗原抗体（PCNA）u抗核糖体P蛋白抗体为SLE的高特异性指标，阳性率在10-40%。uSLE患者伴有狼疮性脑病时，此抗体阳性率可达56-90%。SLE患者出现核糖体P蛋白抗体与中枢神经系统、肝脏或肾脏受累有关。在抗核抗体阴性的SLE患者，抗核糖体抗体阳性有重要诊断价值。抗ds-DNA抗体uSLE 的血清特异性抗体。u多有致病性（IgG型），与亲和力（高）有关。u与LN与SLE疾病活动性相关，活动期达90

16、。可用于SLE 疾病活动期判断药物疗效观察。u与SLE急性皮疹、血管炎、浆膜腔炎、白细胞减少等有关。抗核小体抗体（ANuA）u核小体是真核细胞染色质的基本复制单位，含组蛋白二聚体H2A-H2B和H3-H4，其外面为146个碱基对组成的双链DNA。u参与SLE发病机制：多克隆B细胞活化剂产生ANuA，先于其他ANA促进抗dsDNA与AHA形成参与LN的发生。抗核小体抗体（ANuA）核小体抗体是SLE的诊断标记，其诊断灵敏度为70-90%。在SLE的活性期，此抗体的检出率几乎为100%，在非活动期的SLE中为62%（相应的dsDNA抗体检出率仅为3.3%）。核小体抗体对SLE的诊断灵敏度高于dsD

17、NA抗体，抗核小体抗体甚至可在dsDNA抗体阴性的病人中检测到。它们是SLE恶化的早期标记，因为它们比dsDNA抗体更早出现。抗组蛋白抗体u可出现于多种结缔组织病，不具有诊断特异性。uSLE：50%活动期SLE 可达90.2%与LN（狼疮性肾炎）相关，与SLE疾病活动性存在一定意义的相关性。u药物性狼疮（DIL）：90%如：异烟肼、苯妥因钠、青霉胺、雌激素等，仅有AHA而无其他ANA，强烈支持DIL。u其他结缔组织病：23-30%如：RA、PBC、SSc等抗rRNP抗体（抗核糖体P抗体）靶抗原：胞浆中60S核糖体大亚基上的磷酸化蛋白。抗rRNP抗体uSLE的高度特异性抗体，与狼疮脑病相关。u常在SLE活动期存在,但不会随病情的缓解立。即消失,可持续1-2年后才转阴。u阳性率：24%u可出现在SLE 早期（ANA及抗dsDNA阴性）。抗AMA-M2抗体u主要见于原发性胆汁性肝硬化阳性率为95%。u抗AMA-M2量值的高低对疾病的预后意义明确，也是原发性胆汁性肝硬化和肝外胆道阻塞性肝硬化的鉴别诊断依据。抗线粒体抗体抗线粒体抗体M2型（型（AMA-M2）