由于抗原抗体反应形成的免疫复合物微粒子对光发生折射课件.ppt
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- 关 键 词:
- 由于 抗原 抗体 反应 形成 免疫 复合物 微粒子 对光 发生 折射 课件
- 资源描述:
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1、第二单元免疫沉淀实验免疫沉淀实验实验一实验一 双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验 在琼脂凝胶中,待检人血清在琼脂凝胶中,待检人血清IgG和羊抗人和羊抗人IgG抗血清在不同孔内各自向四周扩散,在比抗血清在不同孔内各自向四周扩散,在比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线,证明两例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线,证明两者发生特异性结合反应。者发生特异性结合反应。实验原理实验原理v试剂试剂 健康人血清,用生理盐水做健康人血清,用生理盐水做1:51:40系列倍比稀释系列倍比稀释、羊抗、羊抗 人人IgG抗血清、抗血清、1015g/L琼脂糖或琼脂粉琼脂糖或琼脂粉。v仪器仪器 水浴箱、温箱水浴箱、温箱。v材料材料
2、载玻片、微量加样器、打孔器、载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、湿盒等吸管、吸球、湿盒等。实验器材和材料实验器材和材料v 制备琼脂凝胶:用生理盐水配置制备琼脂凝胶:用生理盐水配置1015g/L琼脂,隔水加热煮沸备用。琼脂,隔水加热煮沸备用。v 浇板:将载玻片置于水平台上,用吸管吸取浇板:将载玻片置于水平台上,用吸管吸取44.5ml融化的琼脂倾注于融化的琼脂倾注于玻片上,滴加时注意速度不要过快,要使琼脂盖满整张玻片,使其均匀、玻片上,滴加时注意速度不要过快,要使琼脂盖满整张玻片,使其均匀、饱满,勿溢出并避免产生气泡。饱满,勿溢出并避免产生气泡。v 打孔打孔:待琼脂凝固后,将梅花形打孔模
3、板待琼脂凝固后,将梅花形打孔模板置置于琼脂板下,用直径于琼脂板下,用直径3mm的打孔器打孔,使其孔径为的打孔器打孔,使其孔径为3mm,孔距为,孔距为4mm,孔要求圆整光滑,孔,孔要求圆整光滑,孔缘不能破裂,底部勿与载玻片脱离。缘不能破裂,底部勿与载玻片脱离。v 加样:用加样:用10l微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体,微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体,周围孔分别加入不同稀释度的抗原。周围孔分别加入不同稀释度的抗原。v 温育:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中,温育:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中,37温箱温育温箱温育24h,观察,观察沉淀线。沉淀线。实验方法实
4、验方法v操作示意图操作示意图浇板浇板温育温育打孔打孔加样加样结果判断结果判断中央孔中央孔抗体成分抗体成分周围孔周围孔不同稀释度的抗原不同稀释度的抗原成分(第成分(第1 15 5孔)孔)第第6 6孔孔阴性对照阴性对照123456 以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为人血清人血清IgG的扩散效价。的扩散效价。结果判断结果判断北华大学北华大学 王雪松王雪松 该方法简便易行,结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇该方法简便易行,结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇后所出现沉淀线的特征,对其进行定性分析。若相邻两孔后所出现沉淀线的特征,对其进行定性分析。若相邻两孔内抗原成分完全相同
5、,则形成完全相连的两条沉淀线;若内抗原成分完全相同,则形成完全相连的两条沉淀线;若抗原完全不同,则形成交叉的两条沉淀线;若抗原部分相抗原完全不同,则形成交叉的两条沉淀线;若抗原部分相同,则形成部分相连的两条沉淀线;当抗原存在多种成分同,则形成部分相连的两条沉淀线;当抗原存在多种成分时,则呈现多条沉淀线以至交叉反应线,因此可根据沉淀时,则呈现多条沉淀线以至交叉反应线,因此可根据沉淀线的位置、形状、数目等,初步分析抗原和抗体的纯度、线的位置、形状、数目等,初步分析抗原和抗体的纯度、浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清IgG的检的检测以外,还曾用于诊断
6、和分析某些疾病,如检测测以外,还曾用于诊断和分析某些疾病,如检测AFP、HBsAg等,但敏感度低所需时间长。等,但敏感度低所需时间长。实验讨论实验讨论实验二实验二 单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验 将一定量的羊抗人将一定量的羊抗人IgG抗血清成分混合于琼脂凝胶抗血清成分混合于琼脂凝胶中,制成含有特异性羊抗人中,制成含有特异性羊抗人IgG抗血清的琼脂板,待凝抗血清的琼脂板,待凝固后打孔,并在相应孔中加入待检人血清固后打孔,并在相应孔中加入待检人血清IgG。使待检。使待检血清在琼脂板中向四周呈环状扩散,在两者浓度比例恰血清在琼脂板中向四周呈环状扩散,在两者浓度比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀环,沉
7、淀环的直径或面积当处形成肉眼可见的白色沉淀环,沉淀环的直径或面积与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或国际参考蛋白制成标准曲线,即可用以定量检测人血清国际参考蛋白制成标准曲线,即可用以定量检测人血清IgG浓度。浓度。实验原理实验原理实验器材和材料实验器材和材料v 试剂:试剂:待检人血清、免疫球蛋白工作标准(待检人血清、免疫球蛋白工作标准(IgG含量为含量为10.10mg/ml)、羊抗人)、羊抗人IgG抗血清(单扩效价抗血清(单扩效价1:100)、琼)、琼脂糖或琼脂粉、生理盐水、脂糖或琼脂粉、生理盐水、NaN3。v 仪器:仪器:水浴箱、温
8、箱水浴箱、温箱。v 材料:材料:载玻片、微量加样器、打孔器、载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、三角烧吸管、吸球、三角烧瓶、湿盒半对数坐标纸等瓶、湿盒半对数坐标纸等。实验方法实验方法v 制备抗体琼脂凝胶制备抗体琼脂凝胶:用生理盐水配置用生理盐水配置1015g/L琼脂,加琼脂,加0.01%(0.1g/L)NaN3,隔水加热煮沸琼脂,置,隔水加热煮沸琼脂,置56水浴水浴中备用。吸取中备用。吸取99ml已融化的琼脂于三角烧瓶中,置已融化的琼脂于三角烧瓶中,置56水水浴中保温,将预温的羊抗人浴中保温,将预温的羊抗人IgG抗血清抗血清1ml与琼脂充分混合,与琼脂充分混合,继续保温于继续保温于5
9、6水浴中备用。水浴中备用。v 浇板浇板:将清洁干燥的载玻片置于水平台上,用吸管吸取充分将清洁干燥的载玻片置于水平台上,用吸管吸取充分混匀的抗体琼脂混匀的抗体琼脂44.5ml倾注于玻片上,置室温冷却凝固。倾注于玻片上,置室温冷却凝固。要求浇板时要均匀、平整、无气泡、薄厚均匀。要求浇板时要均匀、平整、无气泡、薄厚均匀。v 打孔打孔:待琼脂凝固后,用打孔器打孔,孔径待琼脂凝固后,用打孔器打孔,孔径3mm,孔距,孔距1012mm。要求孔打得圆整光滑,孔缘不能破裂,底部勿。要求孔打得圆整光滑,孔缘不能破裂,底部勿与玻片分离。与玻片分离。v 加样加样:稀释人免疫球蛋白工作标准品:取冻干人免疫球蛋白稀释人免
10、疫球蛋白工作标准品:取冻干人免疫球蛋白工作标准品工作标准品1支加蒸馏水支加蒸馏水0.5ml,待完全溶解后,用生理盐,待完全溶解后,用生理盐水稀释成不同的稀释度。其稀释范围为水稀释成不同的稀释度。其稀释范围为1:5、1:10、1:20、1:40,IgG相应含量为相应含量为2020、1010、505、252mg/L。稀释。稀释待检血清:将待检血清用生理盐水做待检血清:将待检血清用生理盐水做1:40稀释。用微量加稀释。用微量加样器分别吸取各稀释度的人免疫球蛋白工作标准品样器分别吸取各稀释度的人免疫球蛋白工作标准品10l加加入到标准抗原孔,制备标准曲线。再用同样的方法吸取已入到标准抗原孔,制备标准曲线
11、。再用同样的方法吸取已稀释好的待检血清稀释好的待检血清10l加入到待检血清孔。加入到待检血清孔。v 扩散扩散:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中,将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中,37温箱温育温箱温育24h,观察结果。如果沉淀环不清晰,可用生理盐水浸泡,观察结果。如果沉淀环不清晰,可用生理盐水浸泡23h。v操作示意图操作示意图浇板浇板扩散扩散打孔打孔加样加样1 2 3 45 6 7 8结果判断结果判断第第1、2、3、4、5孔孔标准蛋白标准蛋白第第6、7孔孔待检抗原待检抗原第第8孔孔阴性对照阴性对照结果判断结果判断绘制标准曲线:绘制标准曲线:以各稀释度工作标准的沉淀环直径为横坐标,相应以各稀释度工
12、作标准的沉淀环直径为横坐标,相应孔中的孔中的IgG含量为纵坐标,在半对数纸上按含量为纵坐标,在半对数纸上按Fahey法绘法绘制出标准曲线。制出标准曲线。结果判定:结果判定:待测标本中所含抗原量根据标本孔的沉淀环直径查待测标本中所含抗原量根据标本孔的沉淀环直径查标准曲线,将查得的标准曲线,将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数,即待含量乘以标本的稀释倍数,即待检标本血清中检标本血清中Ig的实际含量。的实际含量。实验讨论实验讨论 单向免疫扩散试验方法简便、易于操作,且重复性和单向免疫扩散试验方法简便、易于操作,且重复性和线性均可信赖。但敏感度稍差,观察结果所需时间较长,线性均可信赖。但敏感度稍差,观察
13、结果所需时间较长,每次需做参考血清对照,不可一次做成,长期使用。应用每次需做参考血清对照,不可一次做成,长期使用。应用此方法除检测人血清此方法除检测人血清IgG含量外,还可用于健康人群或患含量外,还可用于健康人群或患者血清中者血清中IgA、IgM、补体、白蛋白、蛋白酶等蛋白质含、补体、白蛋白、蛋白酶等蛋白质含量的定量测定。量的定量测定。北华大学北华大学 王雪松王雪松实验三实验三 对流免疫电泳对流免疫电泳 在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中,抗原和抗在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中,抗原和抗体的扩散具有一定的特点。在体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓冲液中,大以上的缓冲液中,大部分蛋
14、白质抗原解离带负电荷,在电场中向正极泳动;部分蛋白质抗原解离带负电荷,在电场中向正极泳动;而大部分抗体属于而大部分抗体属于IgG,在此种,在此种pH条件下只带微弱的负条件下只带微弱的负电荷,由于其分子量大,暴露的极性基团少,在电场中电荷,由于其分子量大,暴露的极性基团少,在电场中泳动缓慢,且受电渗作用的影响,带正电荷的液体推动泳动缓慢,且受电渗作用的影响,带正电荷的液体推动抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对流,在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉流,在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉淀线。淀线。实验原理实验原理实验
15、器材和材料实验器材和材料v 试剂:试剂:人血清、抗人血清、人血清、抗人血清、pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液、用、用巴比妥缓冲液配置巴比妥缓冲液配置1%琼脂琼脂。v 仪器:仪器:电泳槽、电泳仪、水浴箱电泳槽、电泳仪、水浴箱。v 材料:材料:孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、吸管、吸球等吸管、吸球等。v 制备巴比妥琼脂凝胶:取出一清洁载玻片,用制备巴比妥琼脂凝胶:取出一清洁载玻片,用75%乙醇冲乙醇冲洗干净,晾干备用。将洗干净,晾干备用。将1%巴比妥琼脂融化后,置巴比妥琼脂融化后,置56水水浴中备用。用吸
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