猪丹毒杆菌的检验课件.ppt

1、实验六实验六 猪丹毒杆菌检验猪丹毒杆菌检验 一、实验目的一、实验目的?1、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；?2、了解检验猪丹毒杆菌的意义。、了解检验猪丹毒杆菌的意义。二、实验说明二、实验说明 猪丹毒猪丹毒(Swine erysipelas)是由猪丹毒杆菌是由猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一种人畜共患传染病，其主要特征引起的一种人畜共患传染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。皮肤坏死与多发性非化脓

2、性关节炎。猪丹毒杆菌分为两个种，即红斑丹毒丝菌和扁桃体猪丹毒杆菌分为两个种，即红斑丹毒丝菌和扁桃体丹毒丝菌，其中仅红斑丹毒丝菌是具有致病力的毒力种，丹毒丝菌，其中仅红斑丹毒丝菌是具有致病力的毒力种，对猪最易感并有很强的致病性，至今已发现对猪最易感并有很强的致病性，至今已发现la,1b,2-24和和N型共型共26个血清型，大约个血清型，大约80%以上的猪源性分离株属以上的猪源性分离株属1型型(la和和1b)和和2型，我国优势血清型也为型，我国优势血清型也为1a,1b和和2型。型。类丹毒类丹毒 不规则鲜红色斑块不规则鲜红色斑块 “大红袍大红袍”心瓣膜增生心瓣膜增生：疵状心内膜炎的病变，：疵状心内膜

3、炎的病变，二尖瓣和主动脉瓣出现菜花样增生物二尖瓣和主动脉瓣出现菜花样增生物 大紫肾大紫肾：典型的败血脾：典型的败血脾;肾淤肾淤血、肿大血、肿大 脾充血肿大脾充血肿大 三、检验程序三、检验程序 检 样显微镜检查直接涂片革兰氏染色镜检血液或血清琼脂平板选取可疑菌落涂片镜检、纯培养马丁肉汤临症表现病理变化染色镜检分离培养分离培养动物试验生化反应PCR鉴定猪丹毒杆菌血清型鉴定结果报告四、操作步骤四、操作步骤（一）增菌（一）增菌 以无菌操作取检样，用乳钵加灭菌砂磨碎，无菌操作将样以无菌操作取检样，用乳钵加灭菌砂磨碎，无菌操作将样品转至营养肉汤中，于品转至营养肉汤中，于36士士1培养培养8 h10h。（二

4、）分离和培养（二）分离和培养 对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼脂培养基上，脂培养基上，37培养培养2448h。或经。或经TSB肉汤肉汤37培养培养24h后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，37培培养养24h。血清琼脂血清琼脂：菌落特：菌落特征：细小、圆形、征：细小、圆形、透明、凸起、灰白透明、凸起、灰白色、有光泽、质软、色、有光泽、质软、露珠样、易混悬于露珠样、易混悬于盐水中。盐水中。血液琼脂血液琼脂：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄溶血：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄

5、溶血环（环（溶血）溶血）TSB肉汤肉汤：轻度：轻度混浊，振动试管混浊，振动试管呈现出云雾状，呈现出云雾状，类似试管刷，有类似试管刷，有少量灰白色粘稠少量灰白色粘稠沉淀，不形成菌沉淀，不形成菌膜和菌环。膜和菌环。革兰氏染色，显微镜观察革兰氏染色，显微镜观察：分离菌均为革兰氏阳性杆菌，菌：分离菌均为革兰氏阳性杆菌，菌体细长、长短不一，有时呈长丝形，单独存在，有时呈短体细长、长短不一，有时呈长丝形，单独存在，有时呈短链或链或V形排列。形排列。四、操作步骤四、操作步骤（三）生化实验（三）生化实验?自自TSA琼脂平板上分别挑取琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼

6、脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。?以无菌操作将各菌分别穿刺接种至以无菌操作将各菌分别穿刺接种至SIM培养基中，将所有培养基中，将所有试管置于试管置于37下培养下培养24-48小时。小时。如试管如试管5：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。（变黑）。四、操作步骤四、操作步骤（三）生化实验（三）生化实验?将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20培养培养7天，逐日天，逐日观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与观察明胶液化现象。如

7、室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳性。性。?V-P试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。四、操作步骤四、操作步骤（三）生化实验（三）生化实验 项目项目 葡萄糖葡萄糖 乳糖乳糖 结果结果 项目项目 枸盐酸盐枸盐酸盐 靛基质靛基质 结果结果-果糖果糖 蔗糖蔗糖 山梨醇山梨醇 鼠李糖鼠李糖 M.R.(M.R.(甲基红甲基红)-硫化氢硫化氢 甘露醇甘露醇 七叶苷七叶苷 木糖木糖 V-P V-P -氧化酶氧化酶 硝酸盐还原硝酸盐还原-过氧化氢酶过氧化氢酶 明胶明胶-不液化

8、不液化 注：表示阳性注：表示阳性;表示阴性。表示阴性。猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤 1、引物：、引物：P1：5-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3 P2：5-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3 （四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤 2、反应体系、反应体系 反应总体积为反应总体积为25 L，其中含有，其中含有12.5 L的的PCR Ma

9、ster Mix，10 mol/L上、下游引物各上、下游引物各1 L,1 g/L DNA模板模板5 L，灭菌双蒸水，灭菌双蒸水6.5 L。（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤 3、反应条件：、反应条件：95，5min 95，1min 63，1min 40次循环次循环 72，1min 72，10min （四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤 4、DNA的提取：的提取：将被检菌株接种于将被检

10、菌株接种于3 mL TSB肉汤中，肉汤中，37振荡培养振荡培养(150 r/min)1012h后，取后，取1 mL培养液于培养液于1.5 mL离心管中，经离心管中，经12000 r/min 4离心离心5 min，弃去上，弃去上清液，用清液，用200L ddH2O或者或者TE缓冲液缓冲液(pH8.0)重悬沉淀，重悬沉淀，再于沸水浴中再于沸水浴中10 min，随后立即在冰中冷却，然后在，随后立即在冰中冷却，然后在12000 r/min及及4条件下离心条件下离心5 min，取上清液为猪丹毒，取上清液为猪丹毒杆菌基因组杆菌基因组DNA模板。模板。（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymer

11、ase Chain Reaction，PCR）猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤 5、电泳检测：取、电泳检测：取5L PCR产物直接经产物直接经1%琼脂凝胶（含琼脂凝胶（含0.5g/mL溴化乙锭溴化乙锭）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）M 1 2 3 4 2000 1000 750 500 250 100 937bp 猪丹毒杆菌猪丹毒杆菌PCR检测结果电泳图检测结果电泳图 说明：说明：MDL2000；1阳性对照；阳性对照；2、3被检样品；被检样品；4阴性

12、对照阴性对照。四、操作步骤四、操作步骤 四、动物实验四、动物实验 1.实验材料实验材料 实验动物：雌性昆明小鼠，体重实验动物：雌性昆明小鼠，体重1822g 器材：器材：1ml注射器，鼠笼，垫料（所有器皿均经高压消毒）。注射器，鼠笼，垫料（所有器皿均经高压消毒）。四、操作步骤四、操作步骤 四、动物实验四、动物实验 2.实验步骤实验步骤 每组取每组取2只小鼠，以每只只小鼠，以每只0.2mL剂量进行一次性腹腔注射剂量进行一次性腹腔注射1只，另一只注射只，另一只注射0.2mL无菌生理盐水，观察，分别记录无菌生理盐水，观察，分别记录小鼠死亡状况。小鼠死亡状况。四、操作步骤四、操作步骤 四、动物实验四、动物实验 3.病理解剖和细菌分离病理解剖和细菌分离 病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏，病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏，触于血清平板，触于血清平板，37培养培养1218h。记录结果。记录结果。（六）结果与报告（六）结果与报告 综合以上生化试验、综合以上生化试验、PCR鉴定和动物实验的结果，报告样品中鉴定和动物实验的结果，报告样品中检出或未检出猪丹毒杆菌。检出或未检出猪丹毒杆菌。