牛病毒性腹泻与粘膜病课件.pptx

1、1BVDVBVDV的流行病学的流行病学 2BVDVBVDV的病原学的病原学 3BVDVBVDV的基因结构及其蛋白的基因结构及其蛋白4BVDVBVDV的研究进展的研究进展 内容摘要内容摘要56BVDVBVDV的防治的防治 BVDVBVDV的主要诊断方法的主要诊断方法 BVDVBVDV的流行病学的流行病学传传 染染 源：病牛和带毒牛是主要传染源。源：病牛和带毒牛是主要传染源。传播途径：主要通过传播途径：主要通过消化道消化道和和呼吸道呼吸道传播传播；直接或；直接或间接间接接触接触也可以传播；也可以传播；吸血昆虫吸血昆虫也是重要的传播也是重要的传播媒介。媒介。易感动物：主要感染牛（肉牛、奶牛），也可感

2、染易感动物：主要感染牛（肉牛、奶牛），也可感染猪。猪。本病多发于寒冷季节，过分拥挤可促进本病本病多发于寒冷季节，过分拥挤可促进本病发生。发生。BVDVBVDV的病原学的病原学 属属黄黄病毒科、病毒科、瘟病毒属瘟病毒属 有囊膜，直径有囊膜，直径2525-3030nmnm，正链正链RNARNA 胎牛肾、睾丸、猪肾、胎羊睾丸可增殖胎牛肾、睾丸、猪肾、胎羊睾丸可增殖传代传代 BVDV BVDV。BVDV BVDV 可以分成致细胞病变可以分成致细胞病变型（型（CPCP）和非致细胞病变型（）和非致细胞病变型（NCPNCP）。）。免疫过氧化物酶技术（IP）NS3的表达与宿主细胞CPE的产生有密切关系。具有自

3、体蛋白酶活性，有较高的保守，可以对瘟病毒进行种、群或型的鉴定与抗BVDV抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸附的主要部位BVDV 基因组具有较高的保守性吸血昆虫也是重要的传播媒介。免疫荧光技术（IFA）ADD YOUR TITLE有囊膜，直径25-30nm，正链RNA免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速，但它需要荧光显微镜，使得此技术无法得到推广应用。BVDV的流行病学血清中和试验重复性高，准确性好，已作为 BVDV 诊断的“金标准”，但血清中和试验在基层使用时，常遇到费时、费力，需要细胞培养等试验室技术问题，无法得到推广。RTPCR 是目前广泛应用的分子生物学技术，对于检测 BVDV

4、的 RNA 是一个合适的方法。研究较多的IBRV诊断蛋白有NS3，E2蛋白排除掉持续性感染牛等隐性感染动物BVDVBVDV的基因结构及其蛋白的基因结构及其蛋白 5-Npro 5-Npro（P20P20）-C(P14)-Erns(gp48)-E1(gp25)-C(P14)-Erns(gp48)-E1(gp25)-E2(gp53)-P7-NS2-3(P125)-NS4A(P10)-NS4B E2(gp53)-P7-NS2-3(P125)-NS4A(P10)-NS4B(P30)-NS5A(P58)-NS5B(P75)-3(P30)-NS5A(P58)-NS5B(P75)-3,其中其中C C，E ER

5、NSRNS，E1E1，E2E2是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白。BVDVBVDV的主要基因、蛋白研究进展的主要基因、蛋白研究进展ADD YOUR TITLE核衣壳组成成核衣壳组成成分，具有免疫分，具有免疫原性原性 BVDV BVDV 基因组基因组具有较高的保具有较高的保守性守性瘟病毒属内高度瘟病毒属内高度保守，在病毒复保守，在病毒复制、病毒制、病毒RNARNA转转译或者病毒多聚译或者病毒多聚蛋白加工过程中蛋白加工过程中具有重要作用具有重要作用5-UTR5-UTRC CNS3NS3E ERNSRNS内有一高度保内有一高度保守结构域守结构域，可，可用于研究亚单用

6、于研究亚单位疫苗，也可位疫苗，也可作为基因工程作为基因工程诊断抗原诊断抗原E2与抗与抗BVDV抗体结合、抗体结合、介导免疫中和反应及介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸与宿主细胞识别、吸附的主要部位附的主要部位Npro具有自体蛋白酶活性具有自体蛋白酶活性，有较高的保守，可以对有较高的保守，可以对瘟病毒进行种、群或型瘟病毒进行种、群或型的鉴定的鉴定v5-UTR5-UTR：55末端无甲基化的末端无甲基化的“帽子帽子”结构，结构，5-5-UTRUTR序列在序列在BVDVBVDV的各毒株间有较高的保守性，因的各毒株间有较高的保守性，因此常根据此常根据5-UTR5-UTR的序列设计引物来检测的序列设计引

7、物来检测 BVDVBVDV或或对对 BVDV BVDV 进行分型进行分型。5-UTR 5-UTR 在病毒转录、翻译在病毒转录、翻译过程中起重要的作用。过程中起重要的作用。v20102010年张兴娟等分别用年张兴娟等分别用5-UTR5-UTR设计一对引物，设计一对引物，预扩增片段预扩增片段125bp125bp；20102010年孟雨等人也利用年孟雨等人也利用5-5-UTRUTR设计一对引物，预扩增片段设计一对引物，预扩增片段218bp218bp，实验证明，实验证明利用利用5-UTR5-UTR设计引物具有很好的特异性和敏感性。设计引物具有很好的特异性和敏感性。vE2E2：是是BVDVBVDV的主要

8、保护性抗原，能诱导机体产生中的主要保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，所以新型疫苗都是针对和抗体，所以新型疫苗都是针对E2E2结构蛋白的。结构蛋白的。也是也是与抗与抗 BVDV BVDV 抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸附的主要部位胞识别、吸附的主要部位，E2 E2 基因一直是国内外学者基因一直是国内外学者研究瘟病毒的重点研究瘟病毒的重点。vE2 E2 是形成是形成 BVD BVD 基因工程疫苗的最好的选择基因工程疫苗的最好的选择。vBVDV E2 DNA BVDV E2 DNA 疫苗是近年来疫苗是近年来 BVDV BVDV 免疫研究的热点。免

9、疫研究的热点。如如20072007吴明福吴明福等构建真核表达质粒等构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-E2 pcDNA3.1(+)-E2 并免疫小鼠，可诱导小鼠产生一定程度的体液和细胞并免疫小鼠，可诱导小鼠产生一定程度的体液和细胞免疫应答。免疫应答。vNS-3NS-3：NS3NS3区域与病毒的毒力，生长特性有区域与病毒的毒力，生长特性有关。关。NS3NS3在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、病毒病毒RNARNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作用。有重要作用。NS3NS3的表达与宿主细胞的表达与宿主细胞CPECPE的产

10、生的产生有密切关系有密切关系。v20092009年魏伟等用年魏伟等用BVDV NS3 BVDV NS3 蛋白中有免疫反蛋白中有免疫反应性的重组片段作为包被抗原，建立了一个应性的重组片段作为包被抗原，建立了一个 BVDV BVDV 抗体检测的间接抗体检测的间接 ELISA ELISA 方法。方法。血清学诊断血清学诊断免疫学诊断免疫学诊断诊断方法的进展诊断方法的进展分子生物学诊断分子生物学诊断1 12 23 3血清学诊断血清学诊断 常见的方法为主要包括血清中和试验常见的方法为主要包括血清中和试验和琼脂扩散试验两种。和琼脂扩散试验两种。琼脂扩散试验准确性较低，检出的结果琼脂扩散试验准确性较低，检出的

11、结果常常有假阳性。常常有假阳性。血清中和试验重复性高，准确性好，已作血清中和试验重复性高，准确性好，已作为为 BVDV BVDV 诊断的诊断的“金标准金标准”，但血清中和试，但血清中和试验在基层使用时，常遇到费时、费力，需要验在基层使用时，常遇到费时、费力，需要细胞培养等试验室技术问题，无法得到推广细胞培养等试验室技术问题，无法得到推广。免疫学诊断免疫学诊断酶联免疫吸酶联免疫吸附试验附试验（ELISAELISA）免疫荧光技免疫荧光技术（术（IFAIFA）免疫过氧化免疫过氧化物酶技术物酶技术（IPIP）免疫荧光技术（免疫荧光技术（IFAIFA）免疫荧光技术（免疫荧光技术（IFAIFA）又称荧光抗

12、体技）又称荧光抗体技术，可用于检测细胞培养物以及病变组织术，可用于检测细胞培养物以及病变组织的冰冻切片中的冰冻切片中 BVDV BVDV 感染情况。感染情况。免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速，免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速，但它需要荧光显微镜，使得此技术无法得但它需要荧光显微镜，使得此技术无法得到推广应用。到推广应用。ELISA ELISA ELISA 常被用于检测组织器官培养物中常被用于检测组织器官培养物中 BVDVBVDV，监测牛群中，监测牛群中 BVD BVD 抗体水平，评估潜伏抗体水平，评估潜伏感染情况。其中最常用的是双抗夹心感染情况。其中最常用的是双抗夹心 ELISA ELISA

13、和间接和间接 ELISA ELISA，也有使用，也有使用 BVDV BVDV 单克隆抗体与单克隆抗体与 ELISA ELISA 联合诊断联合诊断 BVD BVD。研究较多的研究较多的IBRVIBRV诊断蛋白有诊断蛋白有NS3NS3，E2E2蛋白蛋白酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）免疫过氧化物酶技术免疫过氧化物酶技术（IPIP）诊断）诊断 BVDV BVDV 准确、准确、可靠，可用于了解可靠，可用于了解 BVD BVD 的总体分布情况。链酶亲的总体分布情况。链酶亲和素和素-生物素过氧化物酶生物素过氧化物酶检测方法，可以用来检测检测方法，可以用来检测福尔马林固定、石蜡包埋

14、福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中的组织切片中的BVDVBVDV。近年来，为了避近年来，为了避免非特异性染色反免非特异性染色反应，则可以使用单应，则可以使用单克隆抗体克隆抗体+生物素化生物素化抗鼠抗体抗鼠抗体-链酶亲和链酶亲和素过氧化物酶检测素过氧化物酶检测方法方法。免疫过氧化物酶技术（免疫过氧化物酶技术（IPIP）瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、病毒RNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作用RTPCR 是目前广泛应用的分子生物学技术，对于检测 BVDV 的 RNA 是一个合适的方法。如2007吴明福等构建真核表达质粒 pcDNA3.免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速，但它需要荧光显微镜，使

15、得此技术无法得到推广应用。与抗BVDV抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸附的主要部位酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫过氧化物酶技术（IP）1(+)-E2 并免疫小鼠，可诱导小鼠产生一定程度的体液和细胞免疫应答。BVDV E2 DNA 疫苗是近年来 BVDV 免疫研究的热点。PCR引物多数选在BVDV保守区5-UTR和NS3基因内，尤其5UTR是BVDV进行鉴定、基因分型的首选区域。吸血昆虫也是重要的传播媒介。核衣壳组成成分，具有免疫原性本病多发于寒冷季节，过分拥挤可促进本病发生。5-UTR：5末端无甲基化的“帽子”结构，5-UTR序列在BVDV的各毒株间有较高的保守性，因此常根据

16、5-UTR的序列设计引物来检测 BVDV或对 BVDV 进行分型。与传统方法相比，该技术敏感，特异性强，而且应用很广泛，NAH 可直接检测脏器组织和血细胞中的 BVDV。分子生物学诊断分子生物学诊断RT-PCR核酸探针检测核酸探针检测1 12 2RT-PCR RTPCR RTPCR 是目前广泛应用的分是目前广泛应用的分子生物学技术，对于检测子生物学技术，对于检测 BVDV BVDV 的的 RNA RNA 是一个合适的方法。根据是一个合适的方法。根据 BVDV BVDV 基因组序列合成一对或几对特异性基因组序列合成一对或几对特异性引物，可以高度特异、敏感的检测引物，可以高度特异、敏感的检测出器官

17、、组织、细胞培养物中的出器官、组织、细胞培养物中的 BVDVBVDV，并可区别，并可区别 CSFV CSFV、BDVBDV，还可，还可对对 BVDV BVDV 的基因型和生物型作进一的基因型和生物型作进一步的鉴定步的鉴定 PCRPCR引物多数选在引物多数选在BVDVBVDV保守区保守区5-UTR5-UTR和和NS3NS3基因内，尤其基因内，尤其5UTR5UTR是是BVDVBVDV进行鉴定进行鉴定、基因分型的首选区域。、基因分型的首选区域。20072007年年王伟利建立了王伟利建立了 BVDV BVDV 荧光荧光 RT-RT-PCR PCR 检测方法并进行了初步应用，检测方法并进行了初步应用，2

18、0072007年年国家质量监督检验检疫局制定了牛病毒性国家质量监督检验检疫局制定了牛病毒性腹泻腹泻/黏膜病反转录聚合酶链反应操作规程黏膜病反转录聚合酶链反应操作规程有囊膜，直径25-30nm，正链RNA如2007吴明福等构建真核表达质粒 pcDNA3.免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速，但它需要荧光显微镜，使得此技术无法得到推广应用。BVDV 基因组具有较高的保守性具有自体蛋白酶活性，有较高的保守，可以对瘟病毒进行种、群或型的鉴定免疫荧光技术（IFA）RTPCR 是目前广泛应用的分子生物学技术，对于检测 BVDV 的 RNA 是一个合适的方法。研究较多的IBRV诊断蛋白有NS3，E2蛋白吸血昆虫

19、也是重要的传播媒介。NS-3：NS3区域与病毒的毒力，生长特性有关。酶联免疫吸附试验（ELISA）其中最常用的是双抗夹心 ELISA 和间接 ELISA，也有使用 BVDV 单克隆抗体与 ELISA 联合诊断 BVD。根据 BVDV 基因组序列合成一对或几对特异性引物，可以高度特异、敏感的检测出器官、组织、细胞培养物中的 BVDV，并可区别 CSFV、BDV，还可对 BVDV 的基因型和生物型作进一步的鉴定排除掉持续性感染牛等隐性感染动物传播途径：主要通过消化道和呼吸道传播；核酸探针检测（核酸探针检测（NAH）与传统方法相比，该技术敏感，特异性强，而与传统方法相比，该技术敏感，特异性强，而且应

20、用很广泛，且应用很广泛，NAH NAH 可直接检测脏器组织和血细胞可直接检测脏器组织和血细胞中的中的 BVDV BVDV。NAH NAH 技术应用最广泛的是核酸标记法技术应用最广泛的是核酸标记法，按核酸探针标记物不同可分为两类：一类是放射，按核酸探针标记物不同可分为两类：一类是放射性同位素（如性同位素（如 32P 32P，35S35S）标记的）标记的 DNA DNA 探针，另一探针，另一类是用如地高辛、生物素标记的类是用如地高辛、生物素标记的 DNA DNA 探针。核酸探针。核酸探针技术标记简单，特异性好，可长期保存，并且探针技术标记简单，特异性好，可长期保存，并且可以回收利用，制成试剂盒，是

21、一种安全、快速、可以回收利用，制成试剂盒，是一种安全、快速、经济的诊断方法。经济的诊断方法。预防和控制预防和控制 免疫预防和药物治疗免疫预防和药物治疗 健全完善健全完善 BVD BVD 检测体系，加强检测牛群及检测体系，加强检测牛群及牛源生物制品的牛源生物制品的 BVDV BVDV 污染情况污染情况 排除掉持续性感染牛等隐性感染动物排除掉持续性感染牛等隐性感染动物 加强环境监控，在饲养环节加强管理，建加强环境监控，在饲养环节加强管理，建立封闭式牧场管理系统，不进行混合饲养立封闭式牧场管理系统，不进行混合饲养 实施免疫预防、过度到捕杀根除程序实施免疫预防、过度到捕杀根除程序研究较多的IBRV诊断

22、蛋白有NS3，E2蛋白传播途径：主要通过消化道和呼吸道传播；本病多发于寒冷季节，过分拥挤可促进本病发生。NS3在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、病毒RNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作用。加强环境监控，在饲养环节加强管理，建立封闭式牧场管理系统，不进行混合饲养如2007吴明福等构建真核表达质粒 pcDNA3.直接或间接接触也可以传播；其中最常用的是双抗夹心 ELISA 和间接 ELISA，也有使用 BVDV 单克隆抗体与 ELISA 联合诊断 BVD。免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速，但它需要荧光显微镜，使得此技术无法得到推广应用。免疫荧光技术（IFA）BVDV 基因组具有较高的保守

23、性传播途径：主要通过消化道和呼吸道传播；免疫过氧化物酶技术（IP）免疫荧光技术（IFA）又称荧光抗体技术，可用于检测细胞培养物以及病变组织的冰冻切片中 BVDV 感染情况。与抗BVDV抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸附的主要部位BVDVBVDV的病原学的病原学 属属黄黄病毒科、病毒科、瘟病毒属瘟病毒属 有囊膜，直径有囊膜，直径2525-3030nmnm，正链正链RNARNA 胎牛肾、睾丸、猪肾、胎羊睾丸可增殖胎牛肾、睾丸、猪肾、胎羊睾丸可增殖传代传代 BVDV BVDV。BVDV BVDV 可以分成致细胞病变可以分成致细胞病变型（型（CPCP）和非致细胞病变型（）和非致细胞病变型

24、（NCPNCP）。）。BVDVBVDV的基因结构及其蛋白的基因结构及其蛋白 5-Npro 5-Npro（P20P20）-C(P14)-Erns(gp48)-E1(gp25)-C(P14)-Erns(gp48)-E1(gp25)-E2(gp53)-P7-NS2-3(P125)-NS4A(P10)-NS4B E2(gp53)-P7-NS2-3(P125)-NS4A(P10)-NS4B(P30)-NS5A(P58)-NS5B(P75)-3(P30)-NS5A(P58)-NS5B(P75)-3,其中其中C C，E ERNSRNS，E1E1，E2E2是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白是病毒的结构蛋白。其

25、余为非结构蛋白。vNS-3NS-3：NS3NS3区域与病毒的毒力，生长特性有区域与病毒的毒力，生长特性有关。关。NS3NS3在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、病毒病毒RNARNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作用。有重要作用。NS3NS3的表达与宿主细胞的表达与宿主细胞CPECPE的产生的产生有密切关系有密切关系。v20092009年魏伟等用年魏伟等用BVDV NS3 BVDV NS3 蛋白中有免疫反蛋白中有免疫反应性的重组片段作为包被抗原，建立了一个应性的重组片段作为包被抗原，建立了一个 BVDV BVDV 抗体检测的

26、间接抗体检测的间接 ELISA ELISA 方法。方法。分子生物学诊断分子生物学诊断RT-PCR核酸探针检测核酸探针检测1 12 2RT-PCR RTPCR RTPCR 是目前广泛应用的分是目前广泛应用的分子生物学技术，对于检测子生物学技术，对于检测 BVDV BVDV 的的 RNA RNA 是一个合适的方法。根据是一个合适的方法。根据 BVDV BVDV 基因组序列合成一对或几对特异性基因组序列合成一对或几对特异性引物，可以高度特异、敏感的检测引物，可以高度特异、敏感的检测出器官、组织、细胞培养物中的出器官、组织、细胞培养物中的 BVDVBVDV，并可区别，并可区别 CSFV CSFV、BDVBDV，还可，还可对对 BVDV BVDV 的基因型和生物型作进一的基因型和生物型作进一步的鉴定步的鉴定预防和控制预防和控制 免疫预防和药物治疗免疫预防和药物治疗 健全完善健全完善 BVD BVD 检测体系，加强检测牛群及检测体系，加强检测牛群及牛源生物制品的牛源生物制品的 BVDV BVDV 污染情况污染情况 排除掉持续性感染牛等隐性感染动物排除掉持续性感染牛等隐性感染动物 加强环境监控，在饲养环节加强管理，建加强环境监控，在饲养环节加强管理，建立封闭式牧场管理系统，不进行混合饲养立封闭式牧场管理系统，不进行混合饲养 实施免疫预防、过度到捕杀根除程序实施免疫预防、过度到捕杀根除程序