医学精品课件:微生物学检验与临床(研究生班讲座2015年9月修改版).ppt
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1、临床微生物学检验与临床临床微生物学检验与临床 河南省卫生厅临床检验中心金雨琦临床病例分析临床病例分析1.某男,69岁,2010年5月20日因颈椎骨质增生在某三甲医院手术。术前检查各项相关指标均正常。5月23日检查:WBC及其他各项血液学指标均正常,无感染征象。可是病人在被连续6天大剂量使用广谱三代头孢菌素头孢唑肟后,病情急剧恶化,腹泻得不到控制,每日蛋花样水样便腹泻十余次,伴阵发性腹绞痛并高热不退。连续三次血培养;三次大便培养均未检出病原菌。5月28日,出现肺部感染。5月29日呼吸衰竭。5月30日因呼吸衰竭、多器官功能衰竭而死亡。死后尸检检测艰难梭菌A&B毒素 (CDAB)为强阳性。结论:艰难
2、梭菌感染性肠炎并致肺部感染,最后导致呼吸衰竭、多器官功能衰竭而死亡。医疗鉴定结果:院方“抗生素使用欠合理”,使患者出现菌群失调及肺部感染,最终导致呼吸衰竭、多器官功能衰竭并未及时检出病原体及毒素。病人的死亡“属于一级甲等医疗事故”。临床病例分析临床病例分析2.患者高XX,男,54岁,2009年3月16日因颈椎病变入某院进行手术治疗,术后长期使用帕珠沙星,头孢孟多酯钠。3月22日出现腹泻,每日十余次,水泻,呈蛋花样便,伴阵发性腹绞痛,腹胀,高热,体温 38-40。周 围 血 象 :WBC16.0109 ,RBC3.361012,大便常规培养无菌生长,急查电解质:钠、氯、钙、磷均低于正常值;26日
3、检测艰难梭菌A&B毒素 (CDAB)为强阳性,临床诊断为艰难梭菌感染性肠炎;立即停用抗生素,改用甲硝唑口服和铬酸梭菌活菌片,并纠正水、电解质紊乱;29日体温正常,4月1日腹泻停止,大便常规检查正常,外周血象WBC10.1109,RBC3.381012 4月2日复查艰难梭菌A和B毒素,阴性显示,痊愈出院。一、临床微生物学检验的概念一、临床微生物学检验的概念 和任务和任务 临床微生物学检验是检验医学中的一个重要学科。它主要通过人工培养的方法,将各类病原微生物从病人体内分离出来,加以鉴别鉴定并进行药敏试验,从而为临床诊断、治疗和预后判断提供可靠试验依据的实验诊断技术。临床微生物学检验的主要任务是:临
4、床微生物学检验的主要任务是:1、研究感染性疾病的病原体特征,确定病原微生物;2、提供快速、准确的病原学诊断;3、指导临床合理使用抗菌药物;4、对医院感染进行监控;5、提供重大疫情信息(细菌战、生物恐怖袭击、重大疫情信息)。二、临床微生物学的发展和应用现状临床微生物学的发展和应用现状是一对矛盾的主题(一)、临床微生物学的发展令人瞩目1、临床微生物检验新技术发展迅速随着现代科学技术的不断发展,特别是细胞学、免疫学、生物化学、分子生物学等的不断发展,对微生物学的发展起到了极大的推动作用。传统的细菌分离、培养及生化反应技术,已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。新的微生物诊断技术和方
5、法已广泛用于多个领域。近年来国内外学者不断努力,已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法,这些新的微生物学诊断技术能够成功应用于临床的主要有:(1)、快速酶触反应及细菌代谢产物的检测 快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶或其他代谢产物,按酶和产物的特性,选用相应的底物和指示剂,将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化,确定待分离的可疑菌株,反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。传统的细菌酶触反应的培养基有两个:EMB(Eosin Methylene Blue)培养基 酸类 pH 菌落紫黑色具有金属光泽 分解 乳糖 不分解 不
6、产酸 pH 不变 菌落无色半透明 S、S(Salmonella and Shigella)agar 酸类物质 pH 菌落红色 分解 乳糖 不分解 不产酸 pH 不变 菌落无色 大肠埃希氏菌和伤寒沙门氏菌在SS琼脂上的菌落特征现在的发展(2)、免疫学方法检测细菌抗原或抗体的技术在细菌诊断中利用免疫学的各种方法简化了病原微生物的鉴定程序,因而日益受到人们的极大关注。抗血清凝集技术早在1933年,Lancefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善,尤其是单克隆抗体的制备,明显提高了细菌凝集实验的特异性,被广泛用于细菌的分型和鉴定,如沙门氏菌、志贺氏菌属、霍乱弧
7、菌等。乳胶凝集实验将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上,通过抗体与相应的细菌抗原结合,产生肉眼可见的凝集反应。业已用于鉴定大肠杆菌O157;H7 荧光抗体检测技术 是用于快速检测细菌的免疫学检测技术。在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清,经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。可快速、直观地检出样品中少量的病原菌。协同凝集试验(COA)业已证实,葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与人及各种哺乳动物IgG的Fc段结合的能力,而不影响抗体Fab段的活性。近年来国内外学者采用抗体致敏的SPA检测细菌即协同凝集试验。如Rahman等用协同凝集试验鉴定霍乱弧菌O1群的初代分离物做快速筛选,比常规法节省时间。它对颗
8、粒性抗原和可溶性抗原都有相同的作用。对204份材料用两种方法比较表明协同凝集试验具有较高的特异性和敏感性。酶联免疫测试技术酶联免疫技术的应用,大大提高了检测的敏感性和特异性,现已广泛地应用在病原微生物的检验。如双抗体夹心法做快速细菌鉴定。应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪,是用荧光分析技术通过固相吸附器,用已知抗体来捕捉目标生物体,然后以带荧光的酶联抗体再次结合,经充分冲洗,通过激发光源检测,即能自动读出发光的阳性标本。其优点是检测灵敏度高,速度快,可以在48小时的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞李斯特菌,空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。(3)、
9、分子生物学技术在检测病原微生物中的应用 随着分子生物学和分子化学的飞速发展,对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上,而是从分子生物学水平上研究生物大分子,特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中,核酸探针(Nuclear acid probe)和聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物,业已逐步应用于病原菌的检测和细菌的分类鉴定。核酸探针将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记,加入已变性的被检DNA样品中,在一定条件下即可与该样品中有同源序列的
10、DNA区段形成杂交双链,从而达到鉴定样品中DNA的目的,这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子叫核酸探针或基因探针。核酸探针的应用:用于检测无法培养,不能用作生化鉴定、不可观察的微生物产物以及缺乏诊断抗原等方面的检测,如肠毒素。用于检测同食源性感染有关的病毒病,如检测肝炎病毒,流行病学调查研究,区分有毒和无毒株。检测细菌耐药基因。分析食品是否会被某些耐药菌株污染,判定食品污染的特性。细菌分型,包括rRNA分型。.聚合酶技术(PCR)的应用PCR技术原理所谓PCR反应,及时将已经某些标记物标记的特定微生物的DNA片段加入反应系统作为引物,通过聚合酶的作用,对靶DNA进行扩增使其达到足
11、够的检测量,从而对微生物进行分析鉴定的分子生物学技术。PCR建立在三步重复发生反应的基础上。PCR原理图原理图临床案例:临床案例:变异后的金黄色葡萄球菌的鉴别诊断:金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Stapnylococcalnuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,其中后者是金黄色葡萄球菌的独有基因。因此,检出变异菌种的nuc2编码基因,即可鉴定变异后的金黄色葡萄球菌。当然PCR也存在缺点,主要是系统容易受外源DNA的污染,并随样品中待检DNA一起扩增。另外试验中需要一定的特殊设备
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