植物染色体倍性分析实用课件.ppt

1、应用专家：植物染色体倍性分析、基因组大小分析Partec染色体倍性分析仪在植物研究中的应用植物学研究中Partec倍体分析仪的应用植物的核DNA含量和倍性水平是植物学研究中的基础研究指标。对植物种质资源鉴定、种群进化、物种分类、生态学研究、多倍体育种、单倍体育种、多倍体诱导等多方面都具有重要意义。植物学研究中Partec倍体分析仪的应用生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值。C值是种群进化、物种分类和生态学研究的有利分析工具和证据。由于近缘物种的C值极为相似，因而可以通过C值获取基因组大小这一特征信息，用于构建物种的系统进化树，分析亲缘关系，同时可以通过测定C值来鉴定杂交物种。借助C值与气

2、孔保卫细胞长度、面积正相关的规律，通过测量植物化石的气孔长度和面积，可以用已知参考样本物种的C值推断出相应的古植物C值，用于古植物研究。另外，外来入侵种比同域分布的同属其它种有较小的C值，因此可以预测入侵能力的强弱，并以此作为生态学评估指标。植物学研究中Partec倍体分析仪的应用植物染色体组多倍化是促进物种形成的重要因素之一，大部分开花植物的祖先都经历过一轮或者几轮多倍化。植物类群染色体倍性对研究植物系统进化，澄清植物的物种起源模式有科学研究价值。鉴定染色体倍性是植物单倍体育种的必要环节，例如在花药单倍体育种实验中，再生组织可能是纯单倍体，也可能是混倍体。还可用于多倍体育种，多倍体育种是利用

3、人工诱变或自然变异等，通过细胞染色体组加倍获得多倍体育种材料，用以选育人们需要的优良品种，也需要鉴别是否诱导加倍成功。此外，植物倍性鉴定还可用于分析细胞分裂活动等植物发育研究。植物学研究中Partec倍体分析仪的应用在植物细胞研究中还可以分选出活的原生质体，并通过分选出来的原生质体再生出植株，其中最有意义的就是选出由原生质体融合所产生的异核体。对酸橙(Citrus aurantium L)叶肉原生质体和甜橙(C sineniscvShamouti)胚性愈伤组织原生质体电融合后再生的体细胞杂种进行分析，结果表明，所有的体细胞杂种植株荧光强度是二倍体对照的两倍，这说明两者的原生质体已经融合。倍体分

4、析的传统方法染色体计数与分析 实验方法与步骤实验方法与步骤取每个再生株根部刚发出的小于1 cm的根56条立刻放入饱和对氯二苯溶液中，常温下放置4 h后，转入卡诺(Camoy s)固定液固定24 h，取出的根用蒸馏水冲洗两遍后转入1 molL盐酸溶液，60水浴中解离67 min，然后在蒸馏水中浸泡10 min以上。用卡宝品红染色压片，奥林巴斯显微镜(BH2)400倍下观察根尖细胞染色体并计数，每个再生株观察5条根。荧光显微数码摄像系统即时拍照成像。实验结果实验结果倍性分析与流式细胞术倍性分析与流式细胞术流式细胞分析，又称流式细胞术（FCM），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞

5、或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。特点：（1）单细胞分析。（2）快速分析。（3）多参数相关测量。（4）定性或定量分析细胞。（5）统计学意义明显。（6）分选。嵌入性染料嵌入性染料荧光染料DAPI，直接与细胞内的DNA双螺旋结构中的A-T碱基对结合，从而使细胞在激发光的照射下发特定波长的光，通过判断发射光的强弱来推算A-T碱基对的多少，从而得知DNA的倍性关系。信号检测与分析当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号

6、，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号,下图是以激发光光源波长488nm为例的示意图：荧光信号的线性测量荧光信号的线性测量线性放大：即放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。在倍体分析实验中，待测样本的倍性（荧光强度）为标样的整数倍，在测量时一定选择线性放大。倍体分析仪数据的显示倍体分析仪数据的显示直方图直方图横坐标，X轴表示光强度，强度高的光信号靠右侧显示。纵坐标，Y轴表示数量累计，相同强度的光信号在同一横坐标点（通道）内向Y轴方向累计。DNA-DAPI倍体分析仪测试流程倍体分析方法比较染色体计数法染

7、色体计数法 实验操作复杂 耗时长、检测通量低（不适合大量材料的倍性鉴定）Partec倍体分析仪倍体分析仪 取样容易，不受取材的时间季节限制 可以检测大量样本，节约时间，每天可测超过200个样本，通过改进流程每天可测试1000个样本 仪器自动识别倍体峰值CyFlow PA简单快速-DNA倍体标本上机检测时间小于2分钟；采用Partec专利染色技术，无细胞壁标本处理及染色时间小于 2分钟，有细胞壁标本处理及染色时间小于15分钟。操作便捷-无需制备和染色中期染色体。适用于DAPI和PI（需配备532nm绿色激光器）染色的生物DNA倍体检测；用途广泛-任何植物样品均可被检测：叶、秧苗、根茎、花、果实、

8、种子等。任何动物、海洋及淡水生物均可被检测。高精确性-绝大多数动植物倍体检测精度可以达到1染色体。灵活便携-结构紧凑，便于移动，适用于多种工作场所。Partec倍性分析仪在植物领域的突出优势 可以实现2分钟内完成所有植物（花、叶、茎、根、果实、种子、花粉）样本的染色制备及上机检测；最少的样品处理步骤；可以实现最为精准的DNA含量检测；最简单的仪器操作程序；最省时省力且省钱的后期维护保养；可以为您的论文添加世界上最为完美的DNA峰直方图；可以在您的研究领域开创与DNA含量相关的新篇章。样本的处理（以植物叶片为例）样本的处理（以植物叶片为例）所需试剂：Partec DNA二步法试剂其它工具：刀片、

9、培养皿、30um滤网，样品管、加样枪等实验步骤实验步骤1.取待测新鲜植物叶片0.5平方厘米，置于培养皿中。2.取400ul裂解液加于植物叶片周围，裂解1分钟。3.裂解完成后，用刀片将叶片切碎。4.向切碎的植物叶片中加入染液1600ul，染色1分钟。5.将培养皿中的液体用30um滤网过滤至样品管中6.上样。注意事项注意事项1.所取植物叶片需新鲜，易于切碎，不易过大或过小。2.在切叶片的过程中，尽量切碎植物叶片，避免割植物叶片的情况发生。3.不同样本的染色时间不同，应根据样本特性决定染色时间。大多数植物样本在裂解和染色的时间只需要一分钟种。对于某些特殊的样本，需在研究中摸索最佳的染色时间，适当延长

10、。上样过程中的注意事项上样过程中的注意事项1.选择合适的电压（gain）值，过高的电压值会放大背景噪声，电压值过小则无法采集数据。点击“”调节。2.随着染色时间的增长，样本的信号峰会向右移动，而充分染色的样本不会发生信号右移的情况。实验中如果发生同一样本的重复性不好，应考虑此种情况。3.为了得到最完美的实验结果，建议适当降低样本流速，将标样的位置放到50的位置上。4.如果画面左侧有大量噪声信号出现，请适当提高阈值 “”阈阈 值值阈值用来定义能够被光电倍增管识别的最小或最大信号强度，低于阈值下限或高于阈值上限的信号将不被光电倍增管识别，也不在图形中显示。DNA Control UV-UVDAra

11、bidopsis thaliana-UVDAllium cepa-UVDCrassostrea gigas(Oyster)-UVD疑难解答 校正微球不在正确的范围校正微球不在正确的范围：l 采用标准的清洁程序 l 修改增益校准平衡珠的位置 l 用LL阈值调整增益 疑难解答 样品流动缓慢或者不动，读数时间达到五分钟甚至更长样品流动缓慢或者不动，读数时间达到五分钟甚至更长：l 样品池有污物或管道堵塞，执行紧急清洁程序。l 检查废物瓶密闭且瓶子没有裂缝。l 鞘液、废液瓶拧紧疑难解答 如果不能明显区分特殊峰或细胞株系与背景信号如果不能明显区分特殊峰或细胞株系与背景信号 l 改变鞘液量 l 用校正微球检

12、查 l 重新分析数据 l 更换鞘瓶的内置过滤器 疑难解答 峰很宽且峰相互间很分散或细胞簇不好峰很宽且峰相互间很分散或细胞簇不好 l 检查样品（样品的贮藏，样品中是否有沉淀，准备过程是否有错误等）流动室紧急清洗流动室紧急清洗 将1.6ml0.5%次氯酸钠用一样品管盛装后，置于进样口处，点击START（开始）按钮，运行15秒后，卡住鞘液管，点击STOP停止运行，让液体在管道内停留15分钟来润洗管道；再按START按钮重新启动系统，直到样品测量及自动清洗程序完成。用1.6ml的清洗液重新洗涤，可以洗剂过夜。将1.6ml鞘液装于样品管置于进样口处，点击START按钮运行系统，直到样品测量及自动清洗程序

13、完成。启动校准微球检测CyFlow倍性分析仪的运行是否正常。倍体分析仪关键配置倍体分析仪关键配置 1.可以应用的染料：直接影响到样本处理过程及测试效果 2.激发光源：需与染料配套，光源的使用寿命至关重要。Partec提供世界上仅有的LED UV光源，使用寿命超过20000小时，而目前常用的汞弧灯寿命只有200小时左右。Partec老款倍性分析仪也采用汞弧灯光源，目前汞弧灯已被淘汰名称特点缺点应用范围DAPI1.基本无毒2.染料本身粘附性小3.发光强，对荧光浓度要求低，即低荧光分子结合率下可以获得相对高荧光强度4.在365nm光源照射下可以获得完美结果（Partec独有LED UV光源替代传统汞

14、弧灯 HBO Lamp）5.分辨率高，通常CV1%6.激光光斑定位不重要7.染色时间短，通常小于2分钟，出报告时间快，从样本处理至出结果通常小于5分钟1.只能对A-T碱基染色2.只能比对同一种属内的基因组大小，不能进行种属间的基因组大小鉴定和对比倍体分析最常用的染料细胞周期分析由Partec在全世界推广使用Partec提供世界上独有的专用配套DAPI测试试剂，集细胞核萃取和染色于一体，通常样本染色只需15秒名称特点缺点应用范围PI1.由488nm或532nm光源激发2.能够对整个基因组染色3.能够进行同一种属或不同种属间的基因组大小比对和精确鉴定1.剧毒2.染料本身粘附性高 3.发光弱，对荧光

15、浓度要求高，即高荧光分子结合率下只能获得相对低的荧光强度4.分辨率低，通常 CV3%5.激光光斑需要精确定位6.染色时间长，通常需要15-30分钟，样本处理复杂，需要洗涤染色后的细胞。出报告时间长，从样本处理至出结果通常大于1小时。DNA含量分析基因组大小比对细胞周期Partec提供世界上独有的专用配套PI测试试剂，简化样本处理步骤Ultraviolet imaging high-resolution technology base on 365nm UV light modulePatent:1971,DE1919628 UV HBO Lamp365nm UV-LED light module high-resolutionDAPI stained SpermExcitation by 365nm UV355nm and 375nm UV laser poor-resolution only one peak at X-axis 400谢谢大家！应用专家：植物染色体倍性分析、基因组大小分析，有关植物的流式细胞仪分析实验，欢迎垂询。此课件下载可自行编辑修改，供参考！此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！感谢您的支持，我们努力做得更好！