酶的免疫化学测定课件.ppt

1、中国医学科学院中国协和医中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院鄢盛恺科大学北京协和医院鄢盛恺 主要内容 六、六、同工酶和亚型的测定同工酶和亚型的测定 一、酶的一般特征一、酶的一般特征 二、血清酶二、血清酶 三、酶促反应动力学三、酶促反应动力学 四、酶活性浓度测定技术四、酶活性浓度测定技术 五、五、酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定 七、工具酶及其临床应用七、工具酶及其临床应用 八、临床常用血清酶及其同工酶八、临床常用血清酶及其同工酶二、血清酶的去路二、血清酶的去路 血清酶的半寿期血清酶的半寿期 (T1/2)(T1/2)定义：定义：酶失活至原来一半时所需时间。酶失活至原来一半时所需时间。半寿期

2、半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶，代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶，在血清中持续时间长。在血清中持续时间长。血清酶的失活和排泄血清酶的失活和排泄 酶的清除酶的清除主要是在血管内失活或分解。主要是在血管内失活或分解。血清酶血清酶经蛋白酶水解产物（多肽或氨基酸）经蛋白酶水解产物（多肽或氨基酸）可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基酸后被重吸收，其中大部分可被组织利用，不能酸后被重吸收，其中大部分可被组织利用，不能利用的氨基酸则随尿排出体外。利用的氨基酸则随尿排出体外。返回节返回节 三、血清酶的生理变异三、血清酶的生理变异 1.1.性别性别 少数酶

3、如少数酶如CKCK、ALPALP及及GGTGGT等有性别差异，与血清酶的等有性别差异，与血清酶的 来源组织有关。来源组织有关。2.2.年龄年龄 血清酶的活性随年龄而变化，血清酶的活性随年龄而变化，ALPALP和和GGTGGT到老年时可有到老年时可有 轻度升高。年龄差异也见于同工酶。轻度升高。年龄差异也见于同工酶。3.3.进食进食 过量饮酒可使血清过量饮酒可使血清GGTGGT明显升高。明显升高。4.4.运动运动 多种血清酶活性升高，如多种血清酶活性升高，如CKCK、LDLD、ASTAST、ALDALD和和ALT ALT 等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及等，其升高的幅度与运动量、持续

4、时间、运动频率及 骨骼肌所含的酶量有关。骨骼肌所含的酶量有关。5.5.妊娠妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALPALP、LDLD、LAPLAP和和ALTALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升（少数）等，引起血清中这些酶活性升 高。高。6.6.其他其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变 化及家庭因素有关。化及家庭因素有关。返回节返回节 酶合成异常酶合成异常u合成减少合成减少u合成增多合成增多 酶释放增加酶释放增加:大多数血清酶增高的主要原因大多数血清酶增高的主要原因u细胞内外酶浓度

5、差异细胞内外酶浓度差异u酶蛋白分子量的大小酶蛋白分子量的大小u酶的组织分布酶的组织分布u酶在细胞内定位和存在形式酶在细胞内定位和存在形式 酶的清除异常酶的清除异常 不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同。不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同。如如AMYAMY和和ALPALP经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。返回节返回节 第三节第三节 酶促反应动力学酶促反应动力学 返回章返回章 Michaelis Michaelis 和和MentenMenten提出的酶作用的中间产物学说提出的酶作用的中间产物学说:maxSKmSVV一、米曼氏方程一、米曼氏方程 E

6、+SK1K2K3 返回节返回节 19131913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的 方程式，即米方程式，即米-曼氏方程曼氏方程(Michaelis-Menten(Michaelis-Menten equation):equation):E+PES二、二、KmKm与与Vmax Vmax KmKm值：值：等于酶促反应的初速率为最大速率等于酶促反应的初速率为最大速率VmaxVmax一半一半 时的底物浓度，即时的底物浓度，即V VVmaxVmax时，则时，则KmKmSS。KmKm 在临床上的应用：在临床上的应用：反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。

7、反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的百分率。大反应速度的百分率。根据根据KmKm值选择酶的最适底物。值选择酶的最适底物。确定工具酶用量。确定工具酶用量。确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依 据。据。VmaxVmax：酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一 定酶量下的最大反应速率定酶量下的最大反应速率。返回节返回节 三、酶促反应进程曲线三、酶促反应进程曲线 如将酶反应过程中测得的产物如将酶反应过程中测得的产物P

8、P或底物或底物SS变化量对时间作图，可得酶促反变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线。图中产物应时间进程曲线。图中产物PP或底物或底物SS变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。延滞期延滞期线性反应期线性反应期底物耗尽期底物耗尽期必须根据线性反应期必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。出酶活性浓度。返回节返回节 四、影响酶促反应的因素四、影响酶促反应的因素 底物浓度对酶促反应的影响底物浓度对酶促反应的影响（1 1）当）当SKmSKmSKm时时，反应速率，反应速率与底物浓度与底物浓度SS无关，无关，V VVmaxVmaxK

9、 EK E 称为称为零级反应零级反应，反应速率反应速率与酶浓度与酶浓度EE成正比成正比。酶学测。酶学测定时一般底物浓度可选择为定时一般底物浓度可选择为KmKm的的10102020倍。倍。返回节返回节 常见酶温度转化系数常见酶温度转化系数 252530303737CKCK0.640.641.001.001.561.56LDLD0.750.751.001.001.441.44ALTALT0.760.761.001.001.381.38ASTAST0.730.731.001.001.521.52ALPALP0.780.781.001.001.301.30GGTGGT0.730.731.001.001

10、.311.31CHECHE0.810.811.001.001.261.26HBDHHBDH0.850.851.001.001.101.10 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（v v）达到最大速度）达到最大速度VmaxVmax，即在过量底物存在下的，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度EE之之间存在线性关系。间存在线性关系。第四节第四节 酶活性浓度测定技术酶活性浓度测定技术 返回章返回章 1.1.按反应时间分类按反应时间分类:定时法定时法 连续监测法连续监测法2.2.按检测方法分类按检测方法分

11、类：量气法、分光光度法、荧光法量气法、分光光度法、荧光法 其它方法（其它方法（放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、极谱法、HPLCHPLC或生物发光法等）。或生物发光法等）。一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法 返回节返回节 测定项目测定项目方法原理方法原理测定手段测定手段胆碱酯酶胆碱酯酶氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根电位滴定法电位滴定法脂肪酶脂肪酶三油酸甘油酯悬乳液做底物，生成油酸甘油一三油酸甘油酯悬乳液做底物，生成油酸甘油一酯，浊度下降酯，浊度下降浊度法浊度法淀粉酶淀粉酶淀粉做底物，一定时间后，剩余的淀粉不足

12、以淀粉做底物，一定时间后，剩余的淀粉不足以使碘呈兰色使碘呈兰色时间滴定法时间滴定法丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶赖氏法赖氏法比色法比色法丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶IFCCIFCC推荐法推荐法分光光度法分光光度法丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢，利用过固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢，利用过氧化氢电极氧化氢电极生物传感器生物传感器N-N-乙酰乙酰-氨基葡萄糖苷酶氨基葡萄糖苷酶4-4-甲基伞形酮甲基伞形酮N-N-乙酰乙酰-D-D-氨基葡萄糖苷做底物氨基葡萄糖苷做底物荧光荧光葡萄糖葡萄糖6 6磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶NADPHNADPH在在365nm365nm激发

13、下产生荧光激发下产生荧光荧光荧光 返回节返回节 定时法（固定时间法）定时法（固定时间法）测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。的总量，计算酶促反应平均速度。优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。对酶活性的影响。缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。性期。利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所

14、利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。差。返回节返回节 连续监测法连续监测法 又称速率法或动力学法，指在酶促反应过又称速率法或动力学法，指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间间 的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活 性浓度的方法。性浓度的方法。优点：优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，就反应物变化的多点测定结果连接成线，观察就反应物变化

15、的多点测定结果连接成线，观察 到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活 性，结果准确可靠。性，结果准确可靠。要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。能，自动生化分析仪都能达到这些要求。返回节返回节 连续监测法的种类连续监测法的种类 直接法直接法 是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质，是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质，然后通过特殊的仪器直接检测。然后通过特殊的仪器直接检测。u 基于基于NADHNADH或或NADPHNADPH的反应原理的反应原理 ：LDLD、-H

16、BD-HBD等等u 基于人工合成色素原底物基于人工合成色素原底物 ：ALP ALP、GGTGGT、AMSAMS等等 u 基于氧的消耗基于氧的消耗 ：各种氧化酶：各种氧化酶 间接法间接法 是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类非常有限，很多情况下不得不使用间接法。非常有限，很多情况下不得不使用间接法。l化学法：化学法：如如ChEChE

17、的丁酰硫代胆碱测定法。的丁酰硫代胆碱测定法。l酶偶联法酶偶联法 返回节返回节 Ex Ex 为待测酶，为待测酶，A A为底物，为底物，B B为中间产物。为中间产物。A A、B B二物质的变二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei(Ei(为指示酶为指示酶)，其，其底物为底物为B B，反应产物为，反应产物为P P可直接测定。可直接测定。PBAEiEx二、酶偶联法二、酶偶联法 返回节返回节 酶偶联反应酶偶联反应 最简单的模式为：最简单的模式为：辅助反应辅助反应 如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时还可在始发反

18、应和指示反应之间加其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为：模式为：PCBAEiEaEx 返回节返回节 其中，其中，B B、C C均为中间产物，均为中间产物，EaEa、EiEi都为工具酶。都为工具酶。最后最后一个酶称指示酶一个酶称指示酶EiEi，其他外加的酶都为辅助酶（，其他外加的酶都为辅助酶（EaEa）。）。酶偶联反应原理酶偶联反应原理 (1)(1)当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几个当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在几个时期：时期：预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期预孵育期、延

19、滞期、恒态期、非恒态期。(2)(2)延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶反应较慢且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度且不稳定，称为延滞期。在这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。不能代表测定酶量多少。(3)(3)设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越短越好，测定时间要避开此期。好，测定时间要避开此期。返回节返回节 酶偶联法测定酶偶联法测定ALTALT的吸光度变化图的吸光度变化图 返回节返回节 对酶偶联反应的要求对酶偶联反应

20、的要求 指示酶反应必须是一级反应指示酶反应必须是一级反应 酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在大反应速度必须远远大于测定酶，其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最中间产物浓度很低的条件下进行，并且将此很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则导致误差。工具酶工具酶 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。酶。返回节返回节 根据根据Vx/(K

21、m)xVx/(Km)x：Vi/(Km)iVi/(Km)i的比值来选择指示酶的用量的比值来选择指示酶的用量ViVi，式中式中VxVx为测定酶的测定上限。为测定酶的测定上限。比值为比值为1:101:10、1:1001:100、1:10001:1000时，时，误差误差2828、4 4、0.70.7。实例：实例：在肌酸激酶测定法中，在肌酸激酶测定法中，CKCK的的KmKm为为2.4mmol/L2.4mmol/L，指示酶，指示酶G-G-6-PD6-PD的的KmKm为为0.27mmol/L0.27mmol/L，如将，如将CKCK测定上限定为测定上限定为450U/L450U/L（实际（实际测定时标本稀释测定

22、时标本稀释6060倍，实际为倍，实际为7.5U/L7.5U/L），如希望上述比例为），如希望上述比例为1:1001:100。代入上式：。代入上式：Vx/(Km)xVx/(Km)x：Vi/(Km)I=1:100Vi/(Km)I=1:100 Vi Vi3.13.110103 3minmin1 10.27mmol0.27mmol100100 8.378.3710102 2mmolmmolminmin1 1 L L 1 1 83.7U/L83.7U/L 如反应体系为如反应体系为1ml1ml，只需，只需0.0837U0.0837U的的G-6-PD G-6-PD 即可。即可。返回节返回节 根据米氏方程式来

23、计算，在酶偶联反应中，指示酶催化速度根据米氏方程式来计算，在酶偶联反应中，指示酶催化速度(Vi)(Vi)的的米氏方程式为：米氏方程式为：111001.00165.01min025.0LmmolLmmolVimmol)(1(PKmViViiiKmPPViVi)(返回节返回节 以天冬氨酸氨基转移酶（以天冬氨酸氨基转移酶（ASTAST）为例希望中间产物）为例希望中间产物P P浓度很低，定为浓度很低，定为0.001mmol/L0.001mmol/L，指示酶苹果酸脱氢酶，指示酶苹果酸脱氢酶KmKm为为0.0165mmol/L0.0165mmol/L，如设定，如设定ASTAST上限为上限为300U/L30

24、0U/L（标本为（标本为1:121:12稀释，实测上限为稀释，实测上限为25U/L25U/L）。代入上式：）。代入上式：ViVi0.0014mmol min0.0014mmol min1 11.4U1.4U得得1.4U1.4U，如反应体系为，如反应体系为3ml3ml，则试剂中苹果酸脱氢酶用量为，则试剂中苹果酸脱氢酶用量为466U/L,466U/L,目前试目前试剂中用量为剂中用量为600U/L600U/L。从以上计算来看，试剂中用量是足够的。从以上计算来看，试剂中用量是足够的。方法条件的选择方法条件的选择 尽可能采用连续监测法；减少步骤尽可能采用连续监测法；减少步骤,化学试剂有一定纯度化学试剂有

25、一定纯度,双蒸水双蒸水,使用双试剂。使用双试剂。测定参数的设置测定参数的设置 方法类型、波长、样品量与试剂量、方法类型、波长、样品量与试剂量、稀释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育时稀释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育时 间、延迟间、延迟,监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计算监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计算 因子因子F F值。值。标本的采集、运输与保存标本的采集、运输与保存 影响因素：溶血、抗凝剂、温度等。影响因素：溶血、抗凝剂、温度等。干扰因素的控制干扰因素的控制 反应干扰。污染。底物自行发生反反应干扰。污染。底物自行发生反 应。应。三、血清酶活性浓度测定条件的选择

26、三、血清酶活性浓度测定条件的选择 返回节返回节 不同贮存温度时体液酶的稳定性不同贮存温度时体液酶的稳定性 酶酶室温（室温（2525）冷藏（冷藏（0 044）冰冻（冰冻（-25-25）LDLD1 1周周1 13d3d1 13d3d-GT-GT2d2d1 1周周1 1月月ALDALD2d2d2d2d不稳定不稳定*ALTALT2d2d5d5d不稳定不稳定*ASTAST3d3d1 1周周1 1月月CKCK1 1周周1 1周周1 1月月ChEChE1 1周周1 1周周1 1周周ALPALP2 23d3d2 23d3d1 1月月ACPACP4h 4h 3d3d#3d3d#5-NT5-NT24h24h1 1

27、周周3 3月月AMYAMY1 1月月7 7月月2 2月月LPSLPS1 1周周3 3周周3 3周周LAPLAP1 1周周1 1周周1 1周周*酶不耐融化；酶不耐融化；与同工酶类型有关；与同工酶类型有关；标本未酸化；标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至标本加枸橼酸或醋酸至pH 5pH 5酶活性单位酶活性单位惯用单位惯用单位 惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同，参考范围差别很大，难以进行比较。位。由于单位定义不同，参考范围差别很大，难以进行比较。国际单位国际单位（IUIU）在特定的条件下，每分钟转化在特定的条件下，每分钟转化1 1

28、 molmol底物底物的酶量为一个国际单位。的酶量为一个国际单位。以以IUIU表示，表示，1IU=11IU=1 mol.minmol.min-1-1。KatalKatal单位单位 在规定条件下，每秒钟转化在规定条件下，每秒钟转化1mol1mol底物的酶量为底物的酶量为1kat1kat，1kat=1mol.s1kat=1mol.s-1-1。常用单位为。常用单位为 katalkatal或或 nkatalnkatal。KatKat与与IUIU的换算关系为：的换算关系为：1IU=11IU=1 molminmolmin-1-1=16.67nmols=16.67nmols-1-1=16.67nkatal=

29、16.67nkatal四、酶活性浓度的单位四、酶活性浓度的单位 返回节返回节 酶活性浓度单位酶活性浓度单位 临床上酶活性浓度采用每单位体积（升）所含的酶活临床上酶活性浓度采用每单位体积（升）所含的酶活性单位数表示。性单位数表示。酶活性浓度单位的计算酶活性浓度单位的计算 连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算。连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算。公式如下：公式如下：LvVALU610min/返回节返回节 参考范围与正常上限升高倍数（参考范围与正常上限升高倍数（ULNULN）由于临床实验室进行酶学测定时所选仪器、试剂和方法由于临床实验室进行酶学测定时所选仪器、试剂和方法不同，加

30、之生物学变异等对酶活性影响，常常导致实验室之不同，加之生物学变异等对酶活性影响，常常导致实验室之间所得参考范围差别甚远，应根据各自情况对各种酶建立自间所得参考范围差别甚远，应根据各自情况对各种酶建立自己的参考值。己的参考值。所谓正常上限升高倍数（所谓正常上限升高倍数（ULNULN）是指用测得的酶活性结果除以是指用测得的酶活性结果除以参考范围上限参考范围上限 。便于比较来自不同方法的结果；如将便于比较来自不同方法的结果；如将ULNULN进一步适当分进一步适当分级，更制定出轻度、中度及极度增加的范围，一目了然。有级，更制定出轻度、中度及极度增加的范围，一目了然。有些酶测定要考虑到不同性别、年龄时间

31、时，用些酶测定要考虑到不同性别、年龄时间时，用ULNULN换算更能换算更能正确表达，就不致发生误判。正确表达，就不致发生误判。返回节返回节 临床常用血清酶的测定方法与参考范围（临床常用血清酶的测定方法与参考范围（3737）*国际临床化学联合会（国际临床化学联合会（IFCCIFCC）参考方法；）参考方法；#实际为拟胆碱酯酶（实际为拟胆碱酯酶（PChEPChE）酶酶方法方法参考范围参考范围ALTALT连续监测法连续监测法 底物中含磷酸吡哆醛底物中含磷酸吡哆醛 底物中不含磷酸吡哆醛底物中不含磷酸吡哆醛男：男：45U/L45U/L；女：；女：34U/L34U/L*5 540U/L40U/LASTAST

32、连续监测法连续监测法 底物中含磷酸吡哆醛底物中含磷酸吡哆醛 底物中不含磷酸吡哆醛底物中不含磷酸吡哆醛男：男：35U/L35U/L；女：；女：33U/L33U/L*8 840U/L40U/LALPALP连续监测法（磷酸对硝基苯酚法）连续监测法（磷酸对硝基苯酚法）1 11212岁；岁；500U/L500U/L；男：男：12121515岁岁 750U/L750U/L，2525岁岁4040150U/L150U/L；女：女：1515岁岁4040150U/L150U/LACPACP比色法（磷酸麝香草酚法）比色法（磷酸麝香草酚法）0.50.51.9U/L1.9U/LLDLD连续监测法连续监测法 L LP P

33、，即，即LD-LLD-L法法 P PL L，即，即LD-PLD-P法法252U/L252U/L*200200380U/L380U/LCKCK连续监测法（酶偶联法）连续监测法（酶偶联法）男：男：169U/L169U/L；女：；女：143U/L143U/L*-GT-GT连续监测法（连续监测法（L-L-谷氨酰谷氨酰-3-3-羧基羧基-对硝基苯胺法）对硝基苯胺法）连续监测法（连续监测法（L-L-谷氨酰谷氨酰-对硝基苯胺法）对硝基苯胺法）男：男：55U/L55U/L；女：女：38U/L38U/L*男：男：50U/L50U/L；女：女：30U/L30U/LAMYAMY连续监测法连续监测法 对对-硝基苯麦芽

34、庚糖苷（硝基苯麦芽庚糖苷（4NP-G74NP-G7）法）法 220U/L220U/LLPSLPS固定时间法（乳化液比浊法）固定时间法（乳化液比浊法）110U/L110U/LChEChE#连续监测法（丁酰硫代胆碱法）连续监测法（丁酰硫代胆碱法）5 0005 00012 000U/L12 000U/L 返回节返回节 用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上来讲来讲V V、v v和和L L均为固定值，均为固定值，为常数，则将公式为常数，则将公式 简化为简化为 如如LDLD活性浓度，已知活性浓度，已知NADHNADH的的 为为6.226.22 1

35、0103 3cmcm-1-1.mol.mol-1-1，血，血清量为清量为5050 l l，底物液为，底物液为1ml1ml，比色杯光径为，比色杯光径为1cm1cm，则，则 F=1.05F=1.05 10106 6/6.22/6.22 10 103 3 0.050.05 1=33761=3376FALUmin/LvVF610LvVALU610min/五、系数五、系数K K值的计算与应用值的计算与应用 返回节返回节 连续监测法中常数连续监测法中常数K K值的设置值的设置 测定酶的判断值或参考范围上限测定酶的判断值或参考范围上限，保证测定的可靠，保证测定的可靠，所所 以转氨酶的常数以转氨酶的常数K K

36、一般在一般在30003000左右，不少人宁愿在左右，不少人宁愿在15001500 左右。左右。应考虑到测定时间，应考虑到测定时间，测定时间短到测定时间短到0.50.5分，此时分，此时0.0010.001嗓嗓 音对每分钟音对每分钟A A误差将是误差将是0.0020.002，反之，测定时间延长，反之，测定时间延长 到到2 2分钟，误差也小一半。即测定时间长，则分钟，误差也小一半。即测定时间长，则K K值可以值可以 设置大一些，如测定时间只有设置大一些，如测定时间只有0.50.5分钟，分钟，K K值一般不超值一般不超 过过40004000。改变改变K K值最方便的途径值最方便的途径就是改变标本稀释度

37、，稀释倍数就是改变标本稀释度，稀释倍数 愈大，愈大，K K值愈大。值愈大。返回节返回节 连续监测法中常数连续监测法中常数K K值的检验值的检验l摩尔吸光系数（摩尔吸光系数（）对一定物质而言常是一个定值，但在一）对一定物质而言常是一个定值，但在一些外界条件影响下也会有所变化。些外界条件影响下也会有所变化。对硝基酚：对硝基酚：当当pHpH1010时，时，405nm405nm处其处其为为1850018500。NAD(P)HNAD(P)H：当波长大于当波长大于334nm334nm时，随温度升高，同一波长时，随温度升高，同一波长的的值会轻度下降。值会轻度下降。l值在近似单色光的光源条件下才能成立。值在近

38、似单色光的光源条件下才能成立。l实际实际K K值的测定。值的测定。一些性质稳定的物质一些性质稳定的物质如对硝基酚如对硝基酚.用高纯试剂配成标准品用高纯试剂配成标准品或直接购买，计算出实际或直接购买，计算出实际K K值。值。NAD(P)HNAD(P)H反应有关酶测定的反应有关酶测定的K K值值。葡萄糖终点法测定，产。葡萄糖终点法测定，产生与葡萄糖相等摩尔数的生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)HNAD(P)H。返回节返回节 使用推荐方法和参考方法使用推荐方法和参考方法使用公认的酶校准物或酶参考物使用公认的酶校准物或酶参考物标准化途径标准化途径l 建立原级参考方法建立原级参考方法 l 制备原级参考物

39、制备原级参考物 l 建立参考实验室网络建立参考实验室网络 酶活性浓度测定的参考系统酶活性浓度测定的参考系统六、临床酶学测定的标准化六、临床酶学测定的标准化 返回节返回节 酶的免疫化学测定方法酶的免疫化学测定方法 放射免疫测定（放射免疫测定（RIARIA）、免疫抑制法、化学发光免）、免疫抑制法、化学发光免疫测定（疫测定（CLIACLIA）、酶免疫测定（）、酶免疫测定（EIAEIA）、荧光酶免疫测）、荧光酶免疫测定（定（FEIAFEIA）。）。免疫化学法的结果报告方式免疫化学法的结果报告方式 （1 1）用酶活性浓度单位，结果以）用酶活性浓度单位，结果以U/LU/L表示。表示。（2 2）用质量浓度单

40、位，结果直接用）用质量浓度单位，结果直接用ng/mlng/ml或或 g/Lg/L表示。表示。血清酶活性与酶质量的变化的关系血清酶活性与酶质量的变化的关系 注意两者之间的差异，如注意两者之间的差异，如CK-MBCK-MB活性与质量不平行。活性与质量不平行。第五节第五节 酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定 返回章返回章 优点：优点：灵敏度高，能测定样品中少量或痕量酶。灵敏度高，能测定样品中少量或痕量酶。特异性高，不受体液中其他物质的影响。特异性高，不受体液中其他物质的影响。能测定一些不表现酶活性的酶蛋白；能测定一些不表现酶活性的酶蛋白；特别适用于测定同工酶。特别适用于测定同工酶。局限性：局限性：制备

41、足够量的提纯酶和抗血清非常困难且工作制备足够量的提纯酶和抗血清非常困难且工作量大。量大。测定步骤多，操作繁琐。测定步骤多，操作繁琐。测定成本高。测定成本高。返回节返回节 第六节第六节 同工酶及亚型的测定同工酶及亚型的测定 返回章返回章 概念：概念：同工酶同工酶是催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、是催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质不同的一组酶。理化性质不同的一组酶。亚型亚型指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异形成的指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异形成的 多种形式的一类酶。往往在基因编码产物从细胞内释入多种形式的一类酶。往往在基因编码产物从细胞内释入 血浆时因肽酶作用

42、降解而形成。血浆时因肽酶作用降解而形成。分类：分类：简单分类简单分类原级同工酶和次级同工酶。原级同工酶和次级同工酶。基因分类基因分类单基因决定的同工酶、复等位基因同工单基因决定的同工酶、复等位基因同工 酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。一、同工酶的概念及分类一、同工酶的概念及分类 返回节返回节 二、同工酶的分析方法二、同工酶的分析方法 方法方法同工酶同工酶(或亚型或亚型)的性质差异的性质差异同工酶、亚型同工酶、亚型电泳法电泳法电荷不同电荷不同所有同工酶、亚型所有同工酶、亚型层析法层析法(离子交换层析、亲和层离子交换层析、亲和层析析)电荷不同

43、电荷不同CKCK，LDLD，ALPALP免疫分析法免疫分析法免疫抑制法免疫抑制法特异性抗体反应性不同特异性抗体反应性不同CKCK、LDLD、ACPACP免疫化学测定法免疫化学测定法特异性抗体反应性不同特异性抗体反应性不同CKCK、LDLD、ACPACP、ALPALP、AMYAMY动力学分析法动力学分析法 底物特异性分析法底物特异性分析法底物底物KmKm、亲和力不同、亲和力不同ACP ACP、CKCK、LDLD（-羟丁酸）羟丁酸）抑制剂分析法抑制剂分析法对小分子量的抑制剂的特异对小分子量的抑制剂的特异性抑制不同性抑制不同LDLD（草酸）、（草酸）、ACPACP（L-L-酒石酒石酸）、酸）、ALP

44、ALP（L-L-苯丙氨酸）苯丙氨酸）pH pH分析法分析法最适最适pHpH不同不同ASTAST热失活分析法热失活分析法热稳定性不同热稳定性不同ALPALP蛋白酶水解法蛋白酶水解法对蛋白水解酶敏感度不同对蛋白水解酶敏感度不同LDLD、ASTAST 返回节返回节 电泳法电泳法 电泳材料：电泳材料：醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦及毛细管电泳等。胺凝胶、等电聚焦及毛细管电泳等。区带显色：区带显色：各同工酶区带进行酶促反应显色后，扫描各同工酶区带进行酶促反应显色后，扫描定量，而颜色的深浅与同工酶活性成正比。定量，而颜色的深浅与同工酶活性成正比。巨

45、分子酶产生的原因：巨分子酶产生的原因：酶与免疫球蛋白形成复合物酶与免疫球蛋白形成复合物，如，如CK-BB-IgG CK-BB-IgG。酶与其他蛋白质形成复合物酶与其他蛋白质形成复合物，如，如LD-LD-脂蛋白脂蛋白 。酶亚基或分子之间形成聚合物酶亚基或分子之间形成聚合物，如，如CK-MtCK-Mt聚合物、聚合物、LDLD亚基自身聚合等。亚基自身聚合等。返回节返回节 层析法：层析法：利用同工酶分子量大小、所带电荷多少的不利用同工酶分子量大小、所带电荷多少的不同，以及受某些离子交换剂吸附的强弱程度不同来进同，以及受某些离子交换剂吸附的强弱程度不同来进行分离鉴定的方法。行分离鉴定的方法。柱层析柱层析

46、，如离子交换层析和亲和层析等。，如离子交换层析和亲和层析等。因操作方法因操作方法费时繁琐，一般不用于临床同工酶常规检测，而主要费时繁琐，一般不用于临床同工酶常规检测，而主要用于同工酶的分离、制备、纯化。用于同工酶的分离、制备、纯化。层析法层析法 返回节返回节 免疫抑制法免疫抑制法 根据同工酶的某一种亚基与相应的抗体根据同工酶的某一种亚基与相应的抗体 结合后，酶活性受到抑制，可算出该型同工酶的活性。结合后，酶活性受到抑制，可算出该型同工酶的活性。如如CK-MBCK-MB活性测定。活性测定。免疫沉淀法免疫沉淀法 该法利用同工酶抗体形成抗原抗体复合该法利用同工酶抗体形成抗原抗体复合 物沉淀的原理，减

47、去法可算出同工酶的活性。物沉淀的原理，减去法可算出同工酶的活性。其他免疫学方法测定酶蛋白其他免疫学方法测定酶蛋白 利用酶是蛋白类抗原但利用酶是蛋白类抗原但 含量极微的特点，可应用免疫电泳、含量极微的特点，可应用免疫电泳、RIARIA、EIAEIA和和 CLIACLIA等方法。这类方法的最大特点就是与酶活性无关，等方法。这类方法的最大特点就是与酶活性无关，测定酶的质量。测定酶的质量。免疫分析法免疫分析法 返回节返回节 底物特异性分析法底物特异性分析法 利用不同的同工酶对底物的亲和利用不同的同工酶对底物的亲和力力的差异即可进行分析。的差异即可进行分析。抑制剂分析法抑制剂分析法 利用同工酶之间结构的

48、不同而对同一利用同工酶之间结构的不同而对同一种种抑制剂有不同的亲和性和反应性来进行分析。抑制剂有不同的亲和性和反应性来进行分析。pHpH分析法分析法 利用不同的同工酶可有不同的最适利用不同的同工酶可有不同的最适pHpH进行进行分分析。析。热失活分析法热失活分析法 利用不同同工酶的耐热性不同来进行利用不同同工酶的耐热性不同来进行分分析与鉴定。析与鉴定。动力学分析法动力学分析法 返回节返回节 第七节第七节 工具酶及其临床应用工具酶及其临床应用 返回章返回章 概念概念 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。的酶称为工具酶。工具酶参与的指示反应工具酶参与的

49、指示反应 偶联偶联H H2 2O O2 2工具酶及指示反应：工具酶及指示反应：如常用的如常用的TrinderTrinder反应。反应。NAD(P)+NAD(P)+或或NAD(P)HNAD(P)H偶联的脱氢酶及其指偶联的脱氢酶及其指示反应：示反应：利用氧化利用氧化-还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)HNAD(P)-NAD(P)H的正的正/逆反应后，直接测定逆反应后，直接测定NAD(P)HNAD(P)H的变化量。的变化量。一、工具酶一、工具酶 返回节返回节 临床化学中常用的共通性呈色反应临床化学中常用的共通性呈色反应 呈色系统呈色系统酶酶底物底物 显色剂显色剂呈色呈

50、色氧化酶氧化酶oxidaseoxidase过氧化物酶过氧化物酶（PODPOD）供氧体供氧体（oxygen donoroxygen donor）邻联甲苯胺邻联甲苯胺(OT)(OT)四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（TMBTMB）四甲基联苯胺加硫酸四甲基联苯胺加硫酸邻联茴香胺邻联茴香胺(ODA)(ODA)邻联茴香胺加硫酸邻联茴香胺加硫酸4-4-氨基安替比林氨基安替比林(4-AAP)(4-AAP)3-3-甲基甲基-2-2-苯并噻唑酮腙苯并噻唑酮腙（MBTHMBTH）蓝色蓝色蓝色蓝色黄色黄色黄色黄色红色红色红色红色深红色深红色脱氢酶脱氢酶NADH/NADPHNADH/NADPH过氧化氢酶过氧化氢酶（cata