酶联免疫吸附测定课件.ppt

1、酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）免疫学教研室免疫学教研室 用用示踪物质示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。不可见的反应成为可见的或可测定的。免免疫疫荧荧光光技技术术用用FITC-抗抗IgM单抗计数单抗计数B细胞细胞免免疫疫荧荧光光技技术术课程内容 ELISA的原理的原理 ELISA的分类 间接间接ELISA的具体操作的具体操作 ELISA在医学中的应用实例ELISA的原理 1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原或抗体的固

2、相化 3.抗原或抗体的酶标记E间接ELISA实验目的：实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价实验材料：实验材料：包被抗原：小鼠血清 待检抗体/一抗一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/封封：5%脱脂奶粉(ALB)稀释液/稀稀：pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液）洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20）显色液：OPD（邻苯二胺）终止液/终终：2M硫酸鼠IgG(抗原)兔抗小鼠兔抗小鼠IgG(一抗一抗)HRP-驴抗兔IgG(二抗)免疫Fc段2-12号每孔00uL稀

3、释液，号孔加入200uL一抗，从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，号孔吸取uL，丢弃！此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG葡萄糖氧化酶(GOD)洗涤：3次，1min/次Company Logo聚苯乙烯酶标板 水浴箱Company Logo（二）间接法（测抗体）1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12-半乳糖苷酶(-Gal)包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4过夜只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和

4、制备酶结合物而建立此法。360,450420碱性磷酸酯酶(AP)聚苯乙烯酶标板 水浴箱辣根过氧化物酶(HRP)洗涤：3次，1min/次2-12号每孔00uL稀释液，号孔加入200uL一抗，从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，号孔吸取uL，丢弃！操作步骤包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4过夜洗涤：3次，1min/次加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37 0min洗涤：3次，1min/次封闭：5%脱脂奶粉，37 20min加待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37 30min加底物液显色洗涤：3次，1min/次终止液终止

5、显色空白对照无显色待测样品显色明显EEEE底物液每孔加ul!倍比稀释法与加样AB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 稀释液 顺序顺序(每孔每孔100ul)S稀释液一抗试管S1一一抗抗原原液液AB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 稀释液 2-12号每孔号每孔00uL稀释液，号孔加入稀释液，号孔加入200uL一抗，一抗，从号孔吸取从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，从号孔加到号孔中，混匀，从号孔吸取吸取100uL加到号孔中，混匀，号加到号孔中，混匀，号孔吸取孔吸取uL，丢弃！，丢弃！ELISA的分类（一）直接法（一）直接法（二）间接法（二）间接法（三）双

6、抗体夹心法（三）双抗体夹心法（四）竞争法（四）竞争法 间接法的原理为间接法的原理为利用酶标记的抗抗利用酶标记的抗抗体以检测已与固相体以检测已与固相结合的受检抗体，结合的受检抗体，故称为间接法。故称为间接法。其优点在于只要其优点在于只要变换包被抗原就可变换包被抗原就可利用利用同一酶标抗抗同一酶标抗抗体体建立检测相应抗建立检测相应抗体的方法。可用于体的方法。可用于传染病的诊断。传染病的诊断。（二）间接法（测抗体）（二）间接法（测抗体）酶标二抗一抗AgwashBSAwashwashTMB（三）双抗体夹心法（测抗原）（三）双抗体夹心法（测抗原）只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于只要获得针对受检

7、抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体包被固相载体和和制备制备酶结合物酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。等。包被Ab酶标AbAgTMBwashwashwash（四）竞争法（四）竞争法（HBcAb）当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb，HBcAb；小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不小分子抗原

8、或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。washTMBHBcAg酶标HBcAbwashHBcAb病原微生物及其抗体检测如病原微生物及其抗体检测如:肝炎病肝炎病毒毒,SARS,SARS等等 临床疾病诊断中的应用临床疾病诊断中的应用蛋白质测定蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物瘤标记物 非肽类激素测定：非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定，性激素测定 ELISA在医学中的应用ELISA

9、在其他相关领域中的应用科研服务科研服务食品安全食品安全 环境卫生环境卫生 DH2+H2O2 D+2H2O DH2为供氢体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。酶催化底物液显色E酶/E底 物/DH2显色反应 测定波长nm 辣根过氧化物酶(HRP)邻苯二胺(OPD)四甲替联苯胺(TMB)氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492450449425642碱性磷酸酯酶(AP)4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色红色 400500 葡萄糖氧化酶(GOD)ABTS+HRP+葡萄糖葡萄

10、糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色深蓝色 405420-半乳糖苷酶(-Gal)甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色 360,450420 ELISA在其他相关领域中的应用封闭液/封：5%脱脂奶粉(ALB)包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4过夜加样时从低浓度向高浓度方向进行themegallery.themegallery.阴性反应为无色或极浅。Company LogoELISA在其他相关领域中的应用碱性磷酸酯酶(AP)洗涤：3次，1min/次DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。根据颜色的深浅，以“”、“”表示。加样时从低浓度向高浓度方向进行2M H2

11、SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢ELISA在医学中的应用实例聚苯乙烯酶标板 水浴箱间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。Company LogoELISA在医学中的应用小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。结果的判定肉眼判定结果：肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“”、“”表示。测定测定A值：值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔

12、OD值2倍为阳性。结果的判定空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅待检样品孔显色明显空白对照注意事项 对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行 终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢聚苯乙烯酶标板 水浴箱洗涤：3次，1min/次包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4过夜只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。洗涤：3次，1min/次聚苯乙烯酶标板 水浴箱Company Logo加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37 0

13、minCompany Logo其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。themegallery.加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37 0min如HBeAb，HBcAb；Company Logothemegallery.2-12号每孔00uL稀释液，号孔加入200uL一抗，从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，号孔吸取uL，丢弃！阴性反应为无色或极浅。肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。themegallery.终止液/终：2M硫酸封闭液/封：5%脱脂奶粉(ALB)ELISA在医学中的应用实例

14、三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢Company Logo洗涤：3次，1min/次themegallery.DH2为供氢体，H2O2为受氢体。themegallery.聚苯乙烯酶标板 水浴箱病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等加样时从低浓度向高浓度方向进行酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgGCompany Logo封闭液/封：5%脱脂奶粉(ALB)Company Logo-半乳糖苷酶(-Gal)实验对照的设立及其意义蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检

15、测相应抗体的方法。-半乳糖苷酶(-Gal)如HBeAb，HBcAb；ELISA在其他相关领域中的应用肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。封闭：5%脱脂奶粉，37 20min酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgGCompany Logo聚苯乙烯酶标板 水浴箱移液器 枪头其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。-半乳糖苷酶(-Gal)加样时从低浓度向高浓度方向进行Company Logo终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准Company Logo小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。葡萄糖氧化酶(G

16、OD)什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?Company LogoDH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。实验对照的设立及其意义洗涤：3次，1min/次Company LogoCompany Logo病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅显色液：OPD（邻苯二胺）测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。Company Logo病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢Company Logothemegallery.themegallery.洗涤：3次，1min/次加样时从低浓度向高浓度方向进行此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。移液器 枪头三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37 0min（二）间接法（测抗体）需要搞清楚的问题1.什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。2.ELISA的原理、定义及基本分类3.实验对照的设立及其意义4.了解ELISA在临床中的广泛应用