血栓与止血检测进展课件.ppt

1、1血栓与止血检测进展王鸿利王鸿利上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海血上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海血液学研究所，液学研究所，2000252 近年，随着基础理论和实验技术的近年，随着基础理论和实验技术的发展，血栓和止血检验及其临床应用发展，血栓和止血检验及其临床应用也有了很大的进展，本文就此作一简也有了很大的进展，本文就此作一简述。述。3（一）（一）血小板微颗粒检测血小板微颗粒检测 血小板被激活后，以出芽方式形成囊泡或以血小板被激活后，以出芽方式形成囊泡或以伪足断裂方式形成直径为伪足断裂方式形成直径为0.11.0m的血小板颗的血小板颗粒（粒（Platelet Microparticle,

2、PMP)。PMP的体积较的体积较正常血小板小，但有完整的血小板膜结构和功能正常血小板小，但有完整的血小板膜结构和功能。PMP膜上可表达多种血小板膜糖蛋白（膜上可表达多种血小板膜糖蛋白（GP）b/a（GP b/a）、）、GPb/-、血小、血小板活化因子（板活化因子（PAF）、）、-样前体淀粉蛋白、样前体淀粉蛋白、Ca2+依赖性蛋白酶依赖性蛋白酶Calpainyi以及有促凝作用的磷脂等以及有促凝作用的磷脂等。因此检测血循环中的。因此检测血循环中的PMPPMP可较完整地反映血小板可较完整地反映血小板参与血栓形成和血液凝固的功能。参与血栓形成和血液凝固的功能。45 检测方法检测方法流式细胞术。主要试剂

3、为流式细胞术。主要试剂为CD61 parcp:多甲藻素多甲藻素-叶绿素蛋白标记抗叶绿素蛋白标记抗血小板血小板GPa的单克隆抗体的单克隆抗体 参考值参考值6617个个/104血小板（山东大血小板（山东大学齐鲁医院报道）。学齐鲁医院报道）。6 临床意义临床意义PMP主要用于动脉血栓性疾病的主要用于动脉血栓性疾病的检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标志物。志物。1.急性冠脉综合征（急性冠脉综合征（ACS）：有证据显示，）：有证据显示，PMP参与动脉粥样硬化和血管再梗塞的病理过程参与动脉粥样硬化和血管再梗塞的病理过程。Cawaz等对急性心肌梗死（等对急性

4、心肌梗死（AMI）施行）施行PTCA患者进行系列血小板功能研究，发现患者进行系列血小板功能研究，发现PTCA术后术后患者的血小板数因消耗增加而减少，患者的血小板数因消耗增加而减少，PMP因大量因大量形成而增多，后者又参与冠脉血栓的形成。形成而增多，后者又参与冠脉血栓的形成。Katopodis等对行冠脉血栓形成术的等对行冠脉血栓形成术的ACS患者进患者进行观察，他们将血小板激活状态作为试验组（近行观察，他们将血小板激活状态作为试验组（近期发生期发生AMI、不稳定性心绞痛者），结果发现，、不稳定性心绞痛者），结果发现，试验组患者试验组患者PMP水平较正常对照组明显增高。水平较正常对照组明显增高。7

5、 2.脑血栓形成：对大血管血栓、小血管脑血栓形成：对大血管血栓、小血管血栓、多发性脑梗死和阿尔茨海默病患者血栓、多发性脑梗死和阿尔茨海默病患者进行进行PMP检测。结果发现，阿尔茨海默病检测。结果发现，阿尔茨海默病患者的患者的PMP水平与正常对照组无统计学差水平与正常对照组无统计学差异，而其他疾病组患者的异，而其他疾病组患者的PMP水平均显著水平均显著高于正常对照组，且治疗后有明显的降低高于正常对照组，且治疗后有明显的降低，而且小血管血栓组患者的，而且小血管血栓组患者的PMP水平高于水平高于大血管血栓组患者。表明大血管血栓组患者。表明PMP水平的增高水平的增高，主要反映小动脉的血栓形成和血栓阻塞

6、，主要反映小动脉的血栓形成和血栓阻塞。8（二）（二）血小板血小板-白细胞聚集体检测白细胞聚集体检测 血小板被激活后，血小板释放血小板被激活后，血小板释放P-选择选择素（素（P-selectin或或GMP-140）。）。P-选择素选择素与白细胞和（或）单核细胞膜上的与白细胞和（或）单核细胞膜上的P-选择选择素配体糖蛋白素配体糖蛋白-1（PSLG-1）结合形成血小）结合形成血小板板-白细胞聚集物（白细胞聚集物（Platelet-Leucocyte Aggre-gate,PLA)和（或）血小板和（或）血小板-单核细胞聚集单核细胞聚集物物 （Platelet-Monocyte Aggregate）。该

7、聚集体是反映动脉血栓形成的特异性。该聚集体是反映动脉血栓形成的特异性标志物之一。标志物之一。9 检测方法检测方法流式细胞术。主要试剂为流式细胞术。主要试剂为FTTC标记的鼠抗人标记的鼠抗人GPIb（CD42b）单克）单克隆抗体，藻红蛋白标记的抗人白细胞隆抗体，藻红蛋白标记的抗人白细胞CD45单克隆抗体，单克隆抗体，FTTC标记的鼠抗人标记的鼠抗人P-selectin（CD62b）单克隆抗体。）单克隆抗体。参考值参考值瑞典学者报道血小板瑞典学者报道血小板-白细胞白细胞聚集物为聚集物为15.38.5（PLA/L）。）。10 临床意义临床意义动物实验和临床研究表明动物实验和临床研究表明，PLA是更敏

8、感和更特异的血栓标志物。是更敏感和更特异的血栓标志物。一组一组93例胸痛患者，其中例胸痛患者，其中9例为例为AMI患者，患者，其血小板其血小板-单核细胞聚集物为单核细胞聚集物为34.210.3，84 例非例非AMI胸痛患者的血小板胸痛患者的血小板-单核细胞聚单核细胞聚集体为集体为19.31.4，二组差异显著（，二组差异显著（0.05）；）；AMI胸痛组和非胸痛组和非AMI胸痛组患者的胸痛组患者的血小板血小板-单核细胞聚集物水平均较单核细胞聚集物水平均较10例正常例正常对照组的血小板对照组的血小板-单核细胞聚集物水平为高单核细胞聚集物水平为高（0.001）。）。11（三）（三）血管性血友病因子裂

9、解蛋白酶活性检测血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测 生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管性血友病因子（性血友病因子（von Willebrand Factor,vWF）主要受）主要受vWF裂解蛋白酶（裂解蛋白酶（vWF C-leaving Proteinase,vWF-CP）的调节。）的调节。vWF CP作用于作用于 vWF分子量为分子量为250000多聚多聚体的体的Try（842）-Met（843）之间的肽键，）之间的肽键，将它们水解成分子量为将它们水解成分子量为176000和和140000的的两个小分子肽段。此时两个小分子肽段。此时vWF不能过度地参与不

10、能过度地参与血小板的粘附和聚集，因此血小板的粘附和聚集，因此vWF CP是是 限制血栓形成的标志物之一。限制血栓形成的标志物之一。121314 检测方法检测方法ELISA。以。以型胶原包被酶标板型胶原包被酶标板，2.5BSA封闭，分别加入未透析的标本和经封闭，分别加入未透析的标本和经Slide-A-Lyzer透析过的标本，一抗为兔抗人透析过的标本，一抗为兔抗人vWF多抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，加入底物，加入底物OPD490nm显色。结果以透析前后的显色。结果以透析前后的OPD490比值作为该份标本的残余胶原结合活性比值作为该份标本的残余胶

11、原结合活性（vWF:CBA或或R-CBA）表示，）表示，R-CBA 越高越高，vWF-CP活性越低。活性越低。参考值参考值83例正常人血浆（例正常人血浆（n30）vWF:CBA 范围为范围为2.140.5（21.99.2）；血清（；血清（n53）vWF:CBA范围为范围为2.452.0（20.510.8）（苏州大学附一院）。）（苏州大学附一院）。15 临床意义临床意义 1.血栓性血小板减少性紫癜（血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：由）：由于患者的于患者的vWF-CP基因缺陷或患者血浆中存基因缺陷或患者血浆中存在抗在抗vWF-CP自身抗体，使自身抗体，使vWF-CP血浆水血浆水平显著降低，不能正

12、常裂解超大分子量的平显著降低，不能正常裂解超大分子量的vWF多聚体（多聚体（UL-vWF）。体内聚集的）。体内聚集的UL-vWF 易于血小板结合，促使血小板粘易于血小板结合，促使血小板粘附和聚集，引起附和聚集，引起TTP病理过程的发生和发病理过程的发生和发展。一组展。一组5例例TTP患者检测患者检测vWF:CBA结果结果为为48.196.5（78.220.2），较正），较正常对照组明显增高，反映患者常对照组明显增高，反映患者vWF-CP明显明显降低。降低。16 2.血管性血友病（血管性血友病（vWD）：据报道，）：据报道，21例例vWF患者血浆患者血浆vWF:CBA水平明显降于水平明显降于30

13、例正常人、例正常人、15例血友病患者及例血友病患者及30例其他出例其他出血性疾病患者（血性疾病患者（0.001）。）。在在vWF中，中，型患者的型患者的vWF:Ag/vWF:CBA比值比值1.0；型患者的型患者的vWF:Ag/vWF:CBA比值比值2.0；型患者的型患者的vWF:Ag/vWF:CBA都极低都极低，其，其vWF:Ag/vWF:CBA比值具有可变性比值具有可变性。17 3.恶性肿瘤：恶性肿瘤患者的恶性肿瘤：恶性肿瘤患者的vWF-CP活活性水平显著低于正常人，伴有远处转移患性水平显著低于正常人，伴有远处转移患者的者的vWF-CP活性水平更低，接受手术治疗活性水平更低，接受手术治疗后患

14、者的后患者的vWF-CP可升高，导致血浆大分子可升高，导致血浆大分子多聚体增多，促使多聚体增多，促使vWF参与血小板粘附和参与血小板粘附和聚集，加剧恶性肿瘤患者的高凝集状态和聚集，加剧恶性肿瘤患者的高凝集状态和血栓形成，反映血栓形成，反映vWF是参与恶性肿瘤血栓是参与恶性肿瘤血栓形成机制之一。形成机制之一。18(四四)单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测（monoclonal antibody specific immobili-zation of platelet antigen,MAIPA）将待测抗体、单抗和血小板共同温育将待测抗体、单抗和血小板共同温育，得

15、到血小板膜，得到血小板膜GP、待测标本和单抗三分、待测标本和单抗三分子复合物，然后加入酶联抗体并以微粒色子复合物，然后加入酶联抗体并以微粒色被抗体固化于微孔中显色，显色深浅与待被抗体固化于微孔中显色，显色深浅与待测抗体水平呈正比。测抗体水平呈正比。参考值参考值抗抗GP b/a阳性，阳性，A值值0.133；抗；抗GPb阳性，阳性，A值值0.2091920 临床意义临床意义检测血小板相关抗体，其检测血小板相关抗体，其敏感度和特异度高于双抗体夹心敏感度和特异度高于双抗体夹心ELISA法法。用于检测。用于检测ITP和同种免疫血小板减少症。和同种免疫血小板减少症。21两种方法对ITP诊断的比较 ELIS

16、A法 MAIPA法PAIgGPAIgAPAIgMGPb/aGPb阳性率（）8127225413敏感性（）8866607566特异性（）5075768394诊断效率（）722722731322(五五)凝血酶激活的纤溶抑制物（凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）检测）检测 凝血酶凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物（凝血酶调节蛋白复合物（T-TM）将由肝脏合成的、分子量为将由肝脏合成的、分子量为55KD的凝血酶的凝血酶激活的纤溶抑制物（激活的纤溶抑制物（Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor,TAFI）的）的Arg（92）-Ala（93）之间的肽键水解）之间的

17、肽键水解后，脱去一个活化肽，后，脱去一个活化肽，TAFI变成活化型的变成活化型的TAFI a。TAFI具有抑制纤溶酶原转化为纤具有抑制纤溶酶原转化为纤溶酶的生物活性，但是溶酶的生物活性，但是TAFI也受蛋白也受蛋白C抑抑制物（制物（PCI）的抑制。）的抑制。2324 检测方法检测方法 采用采用 ELISA测定测定TAFI：Ag。以鼠抗人。以鼠抗人TAFI单克隆抗体包被酶标板单克隆抗体包被酶标板，加入标准品或样品后，再加入辣根过氧，加入标准品或样品后，再加入辣根过氧化物酶标记的抗人化物酶标记的抗人TAFI抗体，充分作用后抗体，充分作用后加入邻苯二胺使之显色，显色深浅与样本加入邻苯二胺使之显色，显

18、色深浅与样本TAFI的含量成正比。的含量成正比。TAFI:A采用发色底物采用发色底物法测定。法测定。参考值参考值 TAFI:Ag（n34）为）为7728（21133）；）；TAFI:A（n34）为）为24 5g/L（1434 g/Lg/L）（上海瑞）（上海瑞金医院）金医院）25 临床意义临床意义 1.深静脉血栓（深静脉血栓（DVT）：）：Tiburg等对脑等对脑74例例初发初发DVT患者的患者的TAFI:Ag 进行检测，发现其水平进行检测，发现其水平增高。口服避孕药的正常生育期妇女，若增高。口服避孕药的正常生育期妇女，若TAFI：Ag水平超过水平超过90，其水平的危险性水平，其水平的危险性水平

19、2倍，此倍，此时患者的纤溶活性减低。时患者的纤溶活性减低。2.动脉血栓（冠心病）：动脉血栓（冠心病）：瑞金医院瑞金医院对对19例冠例冠心病患者检测了心病患者检测了TAFI:Ag和和TAFI:A，发现冠心病，发现冠心病患者的患者的TAFI:Ag和和TAFI:A的水平均高于正常对照的水平均高于正常对照组（组（0.001），），与与Silveira报道报道11例冠心病的例冠心病的检测结果一致，表明患者的纤溶活性明显降低。检测结果一致，表明患者的纤溶活性明显降低。此外，此外，TAFI水平增高也见于不稳定性心绞痛。水平增高也见于不稳定性心绞痛。26 3.微血栓（微血栓（DIC）：）：瑞金医院瑞金医院对对

20、15例例DIC患者检测了患者检测了TAFI:Ag和和TAFI:A，发现患，发现患者的水平明显低于正常对照组（者的水平明显低于正常对照组（0.001），），表明患者纤溶活性明显升高。表明患者纤溶活性明显升高。4.其他：其他：TAFI水平升高还见于感染、水平升高还见于感染、因子因子V Leiden突变；突变；TAFI水平减低还见水平减低还见于某些凝血因子缺乏（血友病、于某些凝血因子缺乏（血友病、F缺乏症缺乏症）、急性早幼粒细胞白血病（）、急性早幼粒细胞白血病（TAFI:A减低减低66，但，但TAFI:Ag正常）。正常）。27 （六）（六）可溶性血管内皮细胞蛋白可溶性血管内皮细胞蛋白C受体检测受体检

21、测 可溶性血管内皮细胞蛋白可溶性血管内皮细胞蛋白C受体（受体（Soluble Endothelial Protein C Receptoe,sEPCR）是由）是由血管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连血管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连EPCR，一部分流离于血浆称，一部分流离于血浆称sEPCR。克隆的膜。克隆的膜连连EPCR cDNA全长全长1.3kb,是一种由是一种由221个氨基酸个氨基酸组成跨膜糖蛋白。膜连组成跨膜糖蛋白。膜连EPCR 通过促进通过促进T-TM复合复合物与蛋白物与蛋白C（PC）的结合，进而放大）的结合，进而放大PC的活性；的活性；此外，此外，EPCR还对体内急性炎

22、症反应河还对体内急性炎症反应河DIC的发的发生具有保护作用。然而，血浆中生具有保护作用。然而，血浆中sEPCR与膜连的与膜连的EPCR具有相反的作用。具有相反的作用。sEPCR也可与也可与PC和活和活化蛋白化蛋白C（APC）结合。抑制）结合。抑制PC的活化和抑制的活化和抑制APC的抗凝活性，减轻膜连的抗凝活性，减轻膜连EPCR的增强的增强PC活化活化和和APC的抗凝作用，所以血浆的抗凝作用，所以血浆sEPCR水平的增高水平的增高市反映血管损伤和抗市反映血管损伤和抗APC抗凝作用的特异性标志抗凝作用的特异性标志物。物。28 检测方法检测方法采用采用 ELISA。以单克隆。以单克隆-抗包被酶标板，

23、分别加入血浆标本和不同抗包被酶标板，分别加入血浆标本和不同稀释度的稀释度的sEPCR标准品后，以生物素标记标准品后，以生物素标记的单克隆二抗作为检测抗体，加入底物后的单克隆二抗作为检测抗体，加入底物后显色，绘制标准曲线。显色，绘制标准曲线。参考值参考值血浆血浆sEPCR为为115.220.7 g/Lg/L29临床意义安徽省立医院报道的结果见表1组别nsEPCR（g/L）值正常对照值20115.2020.70冠心病组30134.2069.60心绞痛17148.9087.90心肌梗死 8117.6033.80糖尿病组56177.0081.40 0.001败血症组30172.6043.70 0.00

24、1SLE合并血栓组 14144.7033.90 0.005SLE血栓组49165.8045.30 0.00130 （七）（七）蛋白蛋白C Global试验试验 凝血酶（凝血酶（T）与血管内皮细胞的凝血酶）与血管内皮细胞的凝血酶调节蛋白（调节蛋白（TM）形成复合物（）形成复合物（T-TM），后），后者使者使PC转化为转化为APC。APC在蛋白在蛋白S（PS）的辅助下，灭活因子的辅助下，灭活因子Va和因子和因子a，还抑制，还抑制纤溶酶原激活抑制物纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1），使纤溶），使纤溶活性增强。然而，活性增强。然而，Agkistrodon contorix蛇毒可以取代蛇毒可以取代T-

25、TM复合物直接激活复合物直接激活PC，使，使PC转化为转化为APC，APC也受也受PAI的抑制。的抑制。31 检测方法检测方法在待测血浆中加入蛇毒温在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直接激活育，蛇毒可直接激活PC，使，使PC转化为转化为AP-C。随后在检测系统中加入。随后在检测系统中加入APTT试剂以检试剂以检测依赖测依赖PC活性的血浆凝固时间（活性的血浆凝固时间（Protein C Activ-Ity Dependent ClottingTime,PCAT）若待测血浆中的）若待测血浆中的PC系统正常，则加入系统正常，则加入Ca2+后后血浆凝固时间显著延长。为了避免血浆凝固时间显著延长。为了避免

26、诸多因素的影响，本试验设计了对照组，诸多因素的影响，本试验设计了对照组，即在实验过程中以缓冲液代替即在实验过程中以缓冲液代替PC激活剂，激活剂，血浆不依赖血浆不依赖PC活性的血浆凝固时（活性的血浆凝固时（PCAT/O），其结果应短于，其结果应短于60s。32 参考值参考值PCAT为为85200s，PCAT/O为为 3355s（n234）。）。临床意义临床意义本试验对本试验对PC活性低于参考值活性低于参考值70的检出率为的检出率为90；对；对PS活性低于参考值的活性低于参考值的60的检出率为的检出率为89；对凝血因子；对凝血因子Leiden突变的检突变的检出率为出率为100；对凝血酶原（；对凝血

27、酶原（F）20210 CA突变的检出率为突变的检出率为84。本试验的检出特异性为。本试验的检出特异性为79。因此，本试验多用于。因此，本试验多用于PC、PS、F Leiden突变和突变和F20210 CA突变的检测，起到蛋白突变的检测，起到蛋白C系统筛选检测作用。但是，本试验也有假阳性，系统筛选检测作用。但是，本试验也有假阳性，见于凝血因子见于凝血因子、活性升高、口服抗凝剂和狼活性升高、口服抗凝剂和狼疮抗凝物质等。疮抗凝物质等。33 （八）（八）蛋白蛋白Z抗原检测抗原检测 蛋白蛋白Z（Protein Z,PZ）是二十世纪）是二十世纪90年代发现的一种血液凝固调节蛋白，为一年代发现的一种血液凝固

28、调节蛋白，为一种维生素种维生素K依赖的单链糖蛋白，由肝脏合成依赖的单链糖蛋白，由肝脏合成后分泌入血。人后分泌入血。人PZ的相对分子量为的相对分子量为62KD，半寿期为半寿期为2.5天，其基因位于天，其基因位于13q34。在。在Ca2+和磷脂存在时，和磷脂存在时，PZ可与可与蛋白蛋白Z依赖的依赖的蛋白酶抑制物（蛋白酶抑制物（Protein Z-Pependent ProtaseInhibItor,ZPI）结合，并进一步与）结合，并进一步与Fa形成形成a-ZPI-PZ复合物而使因子复合物而使因子a在在一分钟内便失去一分钟内便失去95以上的凝血活性。以上的凝血活性。34 检测方法检测方法 目前多采用

29、法国目前多采用法国Stago公公司的司的 ELISA试剂盒检测。试剂盒检测。参考值参考值法国学者报道法国学者报道1.043.57mg/Lmg/L；国内潘学谊报道；国内潘学谊报道60例中青年人例中青年人（2258480）g/Lg/L。妊娠期时。妊娠期时PZ水平逐渐水平逐渐增高。增高。35 临床意义临床意义目前目前PZ在临床上的意义尚不十在临床上的意义尚不十分清楚。分清楚。Wasse等研究发现等研究发现PZ缺乏（缺乏（1.0Mg/LMg/L）在缺血性脑卒中和健康对照中分别为）在缺血性脑卒中和健康对照中分别为20和和5，二者具有显著性差异，二者具有显著性差异，PZ缺乏可使缺乏可使缺血性脑缺血性脑卒中

30、的危险性提高卒中的危险性提高4倍。倍。Soft等报道在急性冠脉综等报道在急性冠脉综合征病人当中合征病人当中PZ水平明显低于水平明显低于健康对照，说明健康对照，说明PZ缺乏是导致急性冠脉综合征的独立的危险因素。缺乏是导致急性冠脉综合征的独立的危险因素。此外，尚有报道认为此外，尚有报道认为PZ缺乏也会导致临床出血症缺乏也会导致临床出血症状，故认为状，故认为PZ具有血栓和出血双种作用，机制未具有血栓和出血双种作用，机制未明。此外，血透患者和口服避孕药者明。此外，血透患者和口服避孕药者PZ水平升高水平升高；口服抗凝剂、流产、早产、先兆子痫、胎儿宫；口服抗凝剂、流产、早产、先兆子痫、胎儿宫内发育迟缓等内

31、发育迟缓等PZ血浆水平降低。血浆水平降低。36蛋白蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物检测依赖的蛋白酶抑制物检测(proteinZ-dependent protease inhibitor,ZPI)原理原理用抗用抗ZPI的多克隆抗体色被酶标板，的多克隆抗体色被酶标板，待测血浆中的待测血浆中的ZPI与固相抗体结合，生物素与固相抗体结合，生物素化抗化抗ZPI单抗与单抗与ZPI抗原结合形成固相多抗抗原结合形成固相多抗-抗原抗原-生物素单抗夹心物。后加入链霉素亲生物素单抗夹心物。后加入链霉素亲和素和素-辣根过氧化物酶复合物，其中辣根过辣根过氧化物酶复合物，其中辣根过氧化物酶作用其特异性底物甲基联苯胺氧化物酶作用其

32、特异性底物甲基联苯胺（TMB）生成有色物质，显色程度与）生成有色物质，显色程度与ZPI含量含量呈正比。呈正比。37参考范围参考范围各室需自行建立各室需自行建立临床意义临床意义ZPI应与应与PZ同时检测。同时检测。PZ缺乏缺乏时，势必使时，势必使ZPI抑制抑制FXa和和FXIa的作用明显的作用明显减低，易形成血栓。减低，易形成血栓。38 （九）（九）组织因子途径抑制物组织因子途径抑制物-因子因子Xa复合物检测复合物检测（tissue factor pathway inhibitor-factor-factorXa complex,TFPI-FXa）利用双抗体夹心法检测血浆中利用双抗体夹心法检测血

33、浆中TFPI/FXa二元二元和和TF/Fa/TFPI/FXa四元复合物。将稀释的血浆四元复合物。将稀释的血浆样品加至预先用特异性抗样品加至预先用特异性抗TFPI抗体色被的酶标板抗体色被的酶标板中温育，抗原中温育，抗原-抗体结合后用生物素标记的纯化鸡抗体结合后用生物素标记的纯化鸡IgY来检测，后者可识别来检测，后者可识别TFPI/FXa复合物表面的复合物表面的新抗原决定簇。加辣根过氧化物酶标记的链霉素新抗原决定簇。加辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素，形成双抗体夹心酶联免疫复合物。加底亲和素，形成双抗体夹心酶联免疫复合物。加底物物TMB，与过氧化物酶反应生成蓝色溶液，最后，与过氧化物酶反应生成蓝色

34、溶液，最后加加0.5mol/LH2SO4终止反应，溶液变成黄色。在终止反应，溶液变成黄色。在波长波长450nm处测得吸光度值。根据标准曲线，计处测得吸光度值。根据标准曲线，计算待测血浆中算待测血浆中TFPI/FXa复合物的含量。复合物的含量。39参考值参考值待建立待建立临床意义临床意义有助于有助于DIC早期和血栓前状态早期和血栓前状态的检测和诊断。的检测和诊断。40（十）（十）抗体芯片技术抗体芯片技术 抗体芯片（抗体芯片（Antibody Microarray）是是 蛋白芯片的一种，是将能识别特异性抗原蛋白芯片的一种，是将能识别特异性抗原的抗体制成微阵列，检测生物样品中抗原的抗体制成微阵列，检

35、测生物样品中抗原蛋白表达模式的方法。这种抗体微阵列可蛋白表达模式的方法。这种抗体微阵列可以在一次简单实验中同时检测样品中的数以在一次简单实验中同时检测样品中的数百甚至数千种蛋白质的表达情况，并且可百甚至数千种蛋白质的表达情况，并且可以在一张芯片上对两种样品的表达模式进以在一张芯片上对两种样品的表达模式进行比较分析。这使抗体芯片在毒性实验、行比较分析。这使抗体芯片在毒性实验、疾病研究和药物开发上有着广泛的应用前疾病研究和药物开发上有着广泛的应用前景。景。41 抗体芯片的检测操作并不要求特殊的抗体芯片的检测操作并不要求特殊的技能，一般常规的操作就可以完成以往极技能，一般常规的操作就可以完成以往极为

36、复杂耗时的工作。整个检测操作流程包为复杂耗时的工作。整个检测操作流程包括：从组织或细胞、体液中提取蛋白质，括：从组织或细胞、体液中提取蛋白质，并用并用Cy5和和Cy3两种不同颜色的荧光分子分两种不同颜色的荧光分子分别标记被检测样品和对照样品，去除多余别标记被检测样品和对照样品，去除多余的标记分子后与芯片杂交孵育，最后扫描的标记分子后与芯片杂交孵育，最后扫描分析结果。整个过程从样品制备到结果分分析结果。整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成。在抗体芯片制作方析只要一天即可完成。在抗体芯片制作方面，如何获得高质量的抗体、提高特异性面，如何获得高质量的抗体、提高特异性、减少交叉反应是制作高质量

37、抗体芯片的、减少交叉反应是制作高质量抗体芯片的主要考虑因素。主要考虑因素。42 抗体芯片技术在血栓与止血检验领域抗体芯片技术在血栓与止血检验领域 有着很好的应用前景。目前正在研发过程有着很好的应用前景。目前正在研发过程中的凝血疾病诊断抗体芯片，是将针对各中的凝血疾病诊断抗体芯片，是将针对各种凝血因子和抗凝血因子的单克隆抗体分种凝血因子和抗凝血因子的单克隆抗体分别固定在合适的片基上，来检测血清标本别固定在合适的片基上，来检测血清标本中各种凝血因子和抗凝血因子的抗原，从中各种凝血因子和抗凝血因子的抗原，从而可以迅速诊断遗传性易栓症和出血性疾而可以迅速诊断遗传性易栓症和出血性疾病。病。43（十一）血

38、栓弹力图（Thrombelastograph hemostasis system,TEG）的检测及其临床应用凝血-血小板-纤溶的筛选作用44参数定义45参数定义46-3+348547247高凝48-3+348547247744950-3+3EPL 015Ly30 08477451纤溶亢进525354（十二）（十二）旋转血栓弹力图旋转血栓弹力图（ROTEM）是在传统的是在传统的TEG基础上，减少振动基础上，减少振动的干扰，增加了流动性和电脑分析系的干扰，增加了流动性和电脑分析系统，使测量间的波动减少，更为准确统，使测量间的波动减少，更为准确、明了。、明了。55常用参数及其意义常用参数及其意义/应

39、用应用 EXTEM是加入重组的是加入重组的TF(rTF)激活外源激活外源凝血系统，很快形成血凝块凝血系统，很快形成血凝块(相当于相当于PT)，即，即为为EXTEM-CT。EXTEM-CT的截断阈值出的截断阈值出现在实验开始后的现在实验开始后的80s，提示需输注，提示需输注PCC或或FFP；EXTEM-MCF：提供血凝块最大强度和：提供血凝块最大强度和稳定的信息，与血小板计数和稳定的信息，与血小板计数和Fg水平有关水平有关。56 FIBTEM-MCF：实验中加入一种血小板：实验中加入一种血小板抑制剂（细胞松弛素抑制剂（细胞松弛素D）即代表）即代表Fg对血凝块对血凝块的强度；的强度；MCF截断阈值

40、出现于实验开始后截断阈值出现于实验开始后的的1015分钟，其降低提示须输注分钟，其降低提示须输注Fg制品；制品；FIBTEM-MCF值正常而值正常而EXTEM-MCF值值减低提示须输注血小板，因此二者须同时检减低提示须输注血小板，因此二者须同时检测。测。57 INTEM是实验中加入鞣花酸活化物，是实验中加入鞣花酸活化物，激活内源凝血系统（类似激活内源凝血系统（类似APTT）；加入）；加入肝素酶（肝素酶（HEPTM）用肝素样抗凝物检查）用肝素样抗凝物检查。比较。比较INTEM-CT和和HEPTEM-CT，可用，可用于对肝素化和鱼精蛋白纠正的定量，二者于对肝素化和鱼精蛋白纠正的定量，二者需同时检测

41、。需同时检测。58 针对围手术期大出血患者床旁针对围手术期大出血患者床旁ROTEM检查，应包括检查，应包括EXTEM、FIBTEM、APTEM以及必要时用以及必要时用INTEM、HEPTEM等。等。对于心脏手术（体外循环）被肝素化的对于心脏手术（体外循环）被肝素化的患者，推荐将患者，推荐将INTEM-CT和和HEPTEM-CT作作为首选的为首选的ROTEM检查。检查。59推荐检查的时间点推荐检查的时间点手术之前手术之前有明显出血，但尚未作纠正治疗时有明显出血，但尚未作纠正治疗时置换一个血容之后置换一个血容之后术后检测有无高凝状态术后检测有无高凝状态60 血制品的输注和止血药的应用血制品的输注和

42、止血药的应用 1、Fg/冷沉淀输注：冷沉淀输注：Fg1.0g/L，或，或ROTEM检测检测EXTEM-MCF50mm及及FIBTEM-MCF12mm。应输注。应输注Fg/冷沉淀冷沉淀。EXTEM-MCF和和FIBTEM-MCF的目标值的目标值（参考值）分别为（参考值）分别为5060mm和和1620mm。若行施肝移植和心脏手术患者，其若行施肝移植和心脏手术患者，其EXTEM-MCF可为可为45mm，FIBTEM-MCF可为可为8mm；若无出血；若无出血EXTEM-MCF的临界值可的临界值可35mm。612、血小板输注：、血小板输注：BPC 50109/L或或EXTEM-MCF45mm+FIBTE

43、M-MCF12mm，应输血小板制品。，应输血小板制品。623、PPC/FFP输注：输注：APTT/PT 正常对照值正常对照值的的1.5倍或倍或EXTEM-MCF 100mm。提示。提示F、F、F、F的血浆水平减低，应的血浆水平减低，应给予给予PPC或或FFP。FFP应输注应输注2030ml/kg（国内（国内1015ml/kg），且可），且可以补充以补充F。634、rFa制品：在制品：在Fg 1.0 1.0g/L，BPC 50109/L和和APTT/PT接近正常情况下，接近正常情况下，其疗效最佳。可以选用其疗效最佳。可以选用TEG/ROTEM检查检查中的中的R/CT、K/CFT缩短以及缩短以及M

44、A/MCF升高升高最能反映最能反映rFa的效果，但的效果，但APTT/PT的缩的缩短不能反映短不能反映rFa的效果。的效果。64（十三）（十三）血小板功能分析仪血小板功能分析仪（platelet function analyzer-100,PFA-100)体外筛选血小板黏附和聚集的体外筛选血小板黏附和聚集的仪器。以标有胶原仪器。以标有胶原/腺上腺素（腺上腺素（CEPI）和胶原）和胶原/ADP（CADP）两种纤维膜为诱导剂，以观察两种纤维膜为诱导剂，以观察膜孔闭合时间（膜孔闭合时间（closure time，CT）为结果。）为结果。参考范围参考范围 CEPI为为61203s；CADP：48 18

45、7s65In Vivo HaemostasisPFA100.avi capillary 200maperture150mepinephrine or ADPplateletvWFerythrocyteFLOW-40 mbarcollagen membranePFA-100 Test Principlelumenfibrinogenplateletcollagen fibrilserythrocyteendothelial cellvWF66 临床应用临床应用 一期止血缺陷的筛选试验。一期止血缺陷的筛选试验。敏感性敏感性：CEPI/CADP为为82.5%/66.9%特异性特异性：CEPI/CAD

46、P为为88.7%/85.5%阴性预测值阴性预测值：CEPI/CADP为为83%/75%阳性预测值阳性预测值：CEPI/CADP为为88%/79%67 vWD：CEPI/CADP的敏感性为的敏感性为88%/87%；特异性为；特异性为95%/95%。血小板无力症：血小板无力症：CT延长，可替代延长，可替代BT，准确，准确、可靠。、可靠。服用服用ASA时：时：CEPI的的CT延长，延长，CADP可正可正常；与其他疾病与药物诱导血小板功能异常；与其他疾病与药物诱导血小板功能异常鉴别的敏感性和特异性分别为常鉴别的敏感性和特异性分别为100%和和50%。68 方法学评价方法学评价 PFA-100操作简便、

47、快速、结果准确。操作简便、快速、结果准确。CEPI/CADP的变异系数为的变异系数为12%/8%，与，与PAgT有良好相关性。有良好相关性。受受PLT、贫血（、贫血（Hct30%）、）、O型血型血型、型、3.8%枸橼酸盐和富含核黄素食物等的枸橼酸盐和富含核黄素食物等的影响；影响；Fg的裂解肽可影响的裂解肽可影响 Fg-vWF/GPb-a的结合的结合69（十四）凝血酶生成(Thrombin generation，TGT)的检测及其临床应用 乏血小板血浆(PPP)试剂(含TF和磷脂)作用于待测血浆，激活凝血系统，最终生成凝血酶。后者将荧光底物ZGGR-AMC*转化为荧光基团AMC，AMC在390n

48、m激发光的作用下发出460nm波长的荧光。荧光读数仪实时检测产生的荧光强度，通过电脑自动绘制凝血酶生成曲线。*ZGGR-AMC:Z-Gly-Gly-Arg-AminoMethyl coumarin凝血酶生成试验的原理70CAT检测法主要有5个指标：延迟时间(lagtime):即从反应开始到凝血酶开始生成所经历的时间(min为单位)。峰值(peak):即生成凝血酶的最大量(nM为单位)。达峰时间(ttpeak):即从反应开始到凝血酶达到最大值所经历的时间(为单位)。凝血酶生成潜力(Endogenous thrombin potential,ETP):即凝血酶生成曲线下的微积分面积，反映凝血酶的生

49、成量(nMmin为单位)。ETP比值：即患者ETP与正常人ETP的比值(%为单位)。7172凝血酶生成试验的临床应用在低分子量肝素(LMWH)治疗中的凝血酶生成7374757677检测抗凝药物治疗：例如华法林治疗(n=78)。随着PT-INR值的递增，TGT的峰值下降，延长时间和达峰时间随之延长。目前认为，华法林治疗要求PT-INR为2.03.0，PT-INR1.5，华法林无效；PT-INR 2.0仍有血栓可能；PT-INR 3.0出血事件增加，PT-INR 5.0出血危险度剧增。Dieri等报道，ETP30%时可致出血倾向，要求抗凝治疗时ETP维持在50%为宜。若以PT-INR与ETP同时用

50、于华法林观察，能更全面反映凝血状态。78附：血管性血友病（vWD）的实验诊断 血管性血友病（血管性血友病（von Willebrand dise-ase,vWD）是由于血管性血友病因子（）是由于血管性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）合成的量或）合成的量或质异常所致的以皮肤、粘膜出血为特征的质异常所致的以皮肤、粘膜出血为特征的遗传性或获得性出血病。遗传性或获得性出血病。7980诊断诊断vWD的常用检测的常用检测筛选试验：筛选试验：BT，APTT，BPC诊断试验：诊断试验：F:C，vWF:Ag，vWF:Rcof分型试验：分型试验：vWF多聚体，多聚体，vWF-胶原结