细胞免疫学技术课件.ppt

1、1/18/20231 1/18/20232细胞免疫学技术种类细胞免疫学技术种类 1/18/20233n一、标本的采取与保存n二、细胞分离技术n三、分离标本的保存技术1/18/20234n一、标本的采取与保存一、标本的采取与保存n（一）血液标本的采取（一）血液标本的采取 无菌采血，抗凝无菌采血，抗凝n1、机械去纤维蛋白法（玻璃珠法）、机械去纤维蛋白法（玻璃珠法）采血过程中，边采边摇采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但本法简便、对淋巴白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但本法简

2、便、对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。n2、肝素抗凝法、肝素抗凝法 肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，防止血液凝固。n3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法 EDTA为螯合剂，可与血液中钙离子结合而抗凝。n马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。1/18/20235n一、标本的采取与保存一、标本的采取与保存n（二）胸腺细胞悬液的制备 n【方法】4周龄健

3、康小鼠，体重1416g。n （1）小鼠颈椎脱臼处死。n （2）迅速取出胸腺。置于100目钢网上。注意无菌，洗干净胸腺上的血管。n （3）轻轻研磨，制成细胞悬液。n （4）用台盼蓝染色，计数。活细胞数90%。看视频看视频1/18/20236n一、标本的采取与保存一、标本的采取与保存n（三）巨噬细胞的采取（三）巨噬细胞的采取n1 1、人巨噬细胞的收集（斑蝥酊敷贴法）、人巨噬细胞的收集（斑蝥酊敷贴法）n2 2、小鼠腹腔巨噬细胞的制备、小鼠腹腔巨噬细胞的制备n【方法】20-25g小白鼠n（1）小鼠颈椎脱臼处死n（2）腹部消毒，无菌注入肝素-Hanks液n（3）吸出腹腔液，洗涤，计数，调整细胞浓度1/1

4、8/20237 二、细胞分离技术二、细胞分离技术 （一）外周血白细胞的分离（一）外周血白细胞的分离 n 根据人外周血红细胞与白细胞的比重不同，其沉降速度随之而异。n 1、自然沉降法 利用RBC自然沉降率较快的分离法。n 抗凝血于室温或37静置3060分钟，血液即分成明显的3层：n 上层为淡黄色血浆，n 紧贴红细胞上面的灰白层为白细胞n 底层为红细胞n 本法所得的白细胞损伤极轻微。1/18/20238n一、标本的采取与保存一、标本的采取与保存n（一）外周血白细胞的分离 n2、加速红细胞沉降法 n 利用高分子量的聚合物（明胶）使红细胞凝聚成串钱状，借以加速红细胞沉降，使之快速与白细胞分离。n 上层

5、富含白细胞n 红细胞凝聚成串钱状沉积在底层，n 本法的细胞得率比自然沉降法高，但明胶增加白细胞粘性，对实验有所影响。1/18/20239n一、标本的采取与保存一、标本的采取与保存n（二）外周血单个核细胞的分离（PBMC）n基本原理 根据人类各种血细胞的比重有所不同，利用一种比重介于1.0751.092之间而接近等渗的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而得以分离各种血细胞群。表表7 人外周血细胞密度一览表人外周血细胞密度一览表 细胞细胞 密度（密度（kg/m3）红细胞红细胞 1.092 粒细胞粒细胞 1.0701.090 淋 巴 细 胞 和 单 核 细 胞淋 巴 细

6、胞 和 单 核 细 胞 1.0601.075 血小板血小板 1.0301.035 1/18/202310n一、标本的采取与保存一、标本的采取与保存n（三）淋巴细胞及其亚群的分离 n1、淋巴细胞的分离n玻器吸附法 将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内，置37 30 min40min，用毛细吸管轻轻吸取悬液，即为淋巴细胞。用适量的Hanks液冲洗平皿，收获即为单核细胞悬液。nL-亮氨酸甲基酯法 n 单核单核-巨噬细胞内富含溶酶体酶，它能摄取嗜溶酶体的巨噬细胞内富含溶酶体酶，它能摄取嗜溶酶体的L-亮亮氨酸甲基酯，集中于溶酶体上，使该酯转化为对细胞本身有氨酸甲基酯，集中于溶酶体上，使该酯转化为对

7、细胞本身有毒性的毒性的L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影响亮氨酸甲基酯，但不影响T、B、NK等细胞。等细胞。用本法获得的淋巴细胞纯度大于用本法获得的淋巴细胞纯度大于99，活力，活力95。1/18/202311n一、标本的采取与保存一、标本的采取与保存n（三）淋巴细胞及其亚群的分离 n 2、淋巴细胞亚群的分离 n根据表面的标志不同，建立能选择性纯化所需细胞的技术。nE花环试验 分离T细胞群n尼龙毛分离方法 分离T、B细胞n亲和层析原理分离淋巴细胞亚群 去除某一细胞群n荧光激活细胞分离仪（FACS）最佳分离方法n磁性微球用于细胞的分离和纯化（磁性微球用于细胞的分离和纯化（MACS技术技术）1/1

8、8/202312免疫磁性微免疫磁性微球的分离原球的分离原理理直接法对细胞进行分类直接法对细胞进行分类抗抗CD3磁球磁球磁球结合磁球结合T细胞细胞加入加入B和和T细胞中细胞中负向选择负向选择正向选择正向选择磁架进行分离磁架进行分离间接法对间接法对T细胞进行分离细胞进行分离单克隆抗体单克隆抗体CD3羊抗鼠修羊抗鼠修饰磁球饰磁球BiomagT细胞细胞T细胞细胞1/18/202313n三、分离标本的保存技术三、分离标本的保存技术n液氮深低温（液氮深低温（196）保存技术）保存技术 n 但降温过程由于但降温过程由于冰晶的形成和渗透压冰晶的形成和渗透压的改变，可导致细的改变，可导致细胞的损伤和部分死亡。因

9、此在冷冻过程要加冷冻保存剂，常胞的损伤和部分死亡。因此在冷冻过程要加冷冻保存剂，常用二甲亚砜用二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。n1、冷冻保存、冷冻保存 n 将待冻细胞悬液加冷冻保存剂，并配成适当浓度，分装将待冻细胞悬液加冷冻保存剂，并配成适当浓度，分装小管。采用小管。采用两步降温法两步降温法，即及时迅速地将其降温至一选择好，即及时迅速地将其降温至一选择好的临界低温作为过渡站，如一的临界低温作为过渡站，如一80低温冰箱过夜，或放在液低温冰箱过夜，或放在液氮罐液面以上一层空间氮罐液面以上一层空间1520h，然后再移放或沉入液氮中。，然后再移放或沉入液氮中。n2、复苏、复苏

10、 复苏复苏解冻必须迅速解冻必须迅速，力争在，力争在20s内使细胞完全融化。内使细胞完全融化。从液氮中取出后迅速移至从液氮中取出后迅速移至40温水中，融化后要充分洗涤重温水中，融化后要充分洗涤重悬于新鲜培养液中，使细胞恢复活力。悬于新鲜培养液中，使细胞恢复活力。1/18/202314 n一、一、T细胞标志及功能的检测细胞标志及功能的检测 n（一）（一）T淋巴细胞受体的检测淋巴细胞受体的检测n1、E受体的检测受体的检测 n （现多用于分离（现多用于分离T细胞）细胞）n2、白细胞介素、白细胞介素-2受体的检测受体的检测 n T细胞激活的特征细胞激活的特征 n （多采用免疫组化学法）（多采用免疫组化学

11、法）1/18/202315n一、T细胞标志及功能的检测n（二）表面抗原的检测n 用单抗检测T细胞表面抗原n方法：标记抗体着染法 抗体致敏花环法n 1、间接免疫荧光法、间接免疫荧光法 n淋巴细胞+抗相应CD的单抗洗涤 再加荧光二抗 洗涤取样制片荧光显微镜观察n计数l00200个淋巴细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性的T细胞百分率。1/18/202316n一、T细胞标志及功能的检测n（二）表面抗原的检测n 2、抗体致敏细胞花环法、抗体致敏细胞花环法 n 淋巴细胞悬液淋巴细胞悬液+抗抗CD抗体致敏的抗体致敏的RBC悬液悬液置置室温片刻，经低速离心室温片刻，经低速离心移放室温移放

12、室温1小时小时/4过夜过夜后后 重悬取样涂片染色镜检重悬取样涂片染色镜检n 共计共计100200个淋巴细胞，以花环形成细胞数与计个淋巴细胞，以花环形成细胞数与计数细胞总数之比为相应数细胞总数之比为相应CD抗原阳性细胞的百分率。抗原阳性细胞的百分率。1/18/202317n一、T细胞标志及功能的检测n（三）（三）T细胞功能的检测细胞功能的检测n 1、T细胞增殖试验细胞增殖试验（T细胞转化试验）细胞转化试验）n 判断判断T细胞功能的一项非特异性体外免疫学检测指标。细胞功能的一项非特异性体外免疫学检测指标。n基本原理基本原理 在体外在体外T细胞与刺激物共育后，细胞代谢和细胞与刺激物共育后，细胞代谢和

13、形态相继会发生一系列的变化，在形态相继会发生一系列的变化，在2448h内，蛋白质内，蛋白质和核酸合成增加，最终和核酸合成增加，最终T细胞呈母细胞化，出现分裂增细胞呈母细胞化，出现分裂增殖现象。殖现象。n 有有形态计数法形态计数法和和放射性核素计数法放射性核素计数法两种两种 1/18/202318n一、T细胞标志及功能的检测n（三）（三）T细胞功能的检测细胞功能的检测n 2、T细胞介导的细胞毒（LMC）试验n 评价机体细胞免疫水平的一种常用指标，n 肿瘤患者的判断预后和观察疗效的指标之一。n （1）形态学检查法 n 淋巴细胞+肿瘤细胞混合共温培养后 瑞氏染色 光镜计数残留的肿瘤细胞数，计算杀伤率

14、。n 本法不需特殊设备，操作较方便，但敏感性较差，不能确切反映细胞的损伤和死亡 1/18/202319n一、T细胞标志及功能的检测n（三）（三）T细胞功能的检测细胞功能的检测n 2、T细胞介导的细胞毒（LMC）试验n（2）放射性核素法 n 一般采用125I-UdR掺入法或51Cr释放法。n 1/18/202320n二、B细胞标志及功能的检测n（一）受体的检测n SmIg标志的检测 n多采用间接荧光免疫法或酶免疫组织化学法n（二）表面抗原的检测 n用相应的CD系列单抗，用荧光免疫、酶免疫组织化学技术加以检测 CDl9、CD20、CD22、CD27等抗原 1/18/202321n二、B细胞标志及功

15、能的检测n（三）B细胞功能的检测 n 1、血清中免疫球蛋白含量测定 n检测方法：琼脂单向扩散试验，方法较粗糙；n 现用ICS仪作自动速率散射比浊法，n 迅速可靠。1/18/2023221/18/202323n二、B细胞标志及功能的检测n（三）B细胞功能的检测 n 2、细胞产生抗体能力的体外试验 n 检测B细胞体外产生抗体的能力，不仅可以了解B细胞功能，还可研究B细胞分化增殖所需的条件，以及T细胞和巨噬细胞等与B细胞相互作用的调节机制。n 1/18/202324n二、B细胞标志及功能的检测n（三）B细胞功能的检测 n 2、细胞产生抗体能力的体外试验 n（1）溶血空斑技术又称空斑形成细胞试验n基本

16、原理 用SRBC免疫动物不同天数后，取脾脏制成细胞悬液。将其与SRBC在半固体琼脂凝胶内混合，倾注于平皿或玻片上使成薄层，置37温育。抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，后者与周围SRBC结合使补体活化而产生溶血，在细胞周围形成一个肉眼可见的透明溶血区，称为溶血斑。每个空斑表示一个抗体生成细胞。1/18/2023251/18/202326n三、NK细胞活性的检测n（一）NK细胞活性检测的方法n 1、形态学检测法n基本原理 将效-靶细胞按一定比例混合共温后，用台盼蓝、伊红丫等（活细胞拒染）染料染色，分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞，由此推算NK细胞的杀伤活性。n用台盼蓝染色，须在3min内完成

17、计数，否则活细胞也将开始摄取染料而着染。伊红丫染色在110min内，死、活细胞比例不变。n本法简便易于掌握，但主观因素较大，也无法计出遭轻微损伤的细胞。1/18/202327n三、NK细胞活性的检测n（一）NK细胞活性检测的方法n 2、酶释放检测法n基本原理 将效-靶细胞共育一段时间后，根据靶细胞破坏后释放的酶量推断死亡的细胞数。通常以乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶为检测指标。取共育后离心的上清液，加酶底物显色。根据光密度的变化确定酶含量的多少。n特点 经济、快速、简便，可定量。影响因素 有培养液、pH、温度以及终止反应的时间等。实际操作时要严格掌握条件 1/18/202328n三、NK细胞活性的检测

18、n（二）NK细胞活性检测的临床意义 n临床的辅助诊断以及判断预后，考核疗效 1/18/202329n四、吞噬细胞检测技术n（一）中性粒细胞的检测n 中性粒细胞的检测包括数量、细胞运动功能以及吞噬和杀菌功能的检测。n1、中性粒细胞吞噬和杀菌功能的检测 n受检细胞悬液内按一定比例加入活的白色念珠菌悬液，混合保温后，加亚甲蓝(美蓝)溶液作活体染色，取样涂片作光镜检查。如胞内白色念珠菌呈蓝色，表示该菌已被杀死，共计100200个细胞，分别求其吞噬率和杀菌率。1/18/202330n四、吞噬细胞检测技术n（一）中性粒细胞的检测n 中性粒细胞的检测包括数量、细胞运动功能以及吞噬和杀菌功能的检测。n1、中性

19、粒细胞吞噬和杀菌功能的检测 n正常情况下，对大肠杆菌的杀菌率90，对金黄色葡萄球菌的杀菌率85 1/18/202331n四、吞噬细胞检测技术n（二）巨噬细胞功能的检测n巨噬细胞功能的检测包括有炭粒廓清试验、吞噬功能检测、溶酶体酶的测定、巨噬细胞促凝血活性测定，以及分泌功能和表面标志检测等。1/18/202332n四、吞噬细胞检测技术n（二）巨噬细胞功能的检测n1、巨噬细胞功能的化学发光法测定n 基本原理 单核-巨噬细胞激活后也能引起呼吸爆发而产生O2、H2O2、1O2、OH、OCl等超氧阴离子，并伴随产生化学发光，因此也可用化学发光法研究单核-巨噬细胞功能和代谢活性。n本法自动化程度高，客观性

20、强，可作为研究单核-巨噬细胞基础理论的一个重要手段。1/18/202333n四、吞噬细胞检测技术n（二）巨噬细胞功能的检测n 2、巨噬细胞表面受体的检测 n成熟的巨噬细胞表面具有Fc受体和C3b受体n检测这些受体可间接判断巨噬细胞的功能n常用抗羊红细胞抗体致敏的羊红细胞悬液作指示物进行EA玫瑰花结试验，和EAC玫瑰花结试验。EA：巨噬细胞（Fc受体）+（抗羊红细胞抗体+羊红细胞）EAC：巨噬细胞（C3b受体）+（抗羊红细胞抗体+羊红细胞+补体）1/18/202334n四、吞噬细胞检测技术n（二）巨噬细胞功能的检测n 3、巨噬细胞功能检测的临床意义、巨噬细胞功能检测的临床意义 n 巨噬细胞的吞噬功能低下见于某些免疫缺陷症及胃癌、肠癌等多种肿瘤病人。n吞噬细胞的功能可作为判断机体抗肿瘤能力的指标，判定肿瘤复发转移的简易指标，也可作为考核肿瘤化疗、放射和免疫治疗疗效的参考指标。1/18/202335n常用ELISA法：试剂盒。