病毒性肝炎血清学检测的基础与实践课件.pptx

1、1.1.为什么为什么ELISAELISA检测抗体容易假阳性检测抗体容易假阳性2.2.检测抗体和抗原的基本原理检测抗体和抗原的基本原理ELISAELISA3.3.病毒性肝炎血清学检测的基础和实践病毒性肝炎血清学检测的基础和实践讲讲 解解 内内 容容A.A.甲型肝炎甲型肝炎B.B.乙型肝炎乙型肝炎C.C.丙型肝炎丙型肝炎D.D.丁型肝炎丁型肝炎E.E.戊型肝炎戊型肝炎4.4.如何克服抗如何克服抗-HEV-HEV检测中的假阳性检测中的假阳性为什么为什么ELISAELISA检测抗体容易假阳性检测抗体容易假阳性?抗体的粘附特性，特别是抗体的粘附特性，特别是IgMIgM抗体抗体 ELISAELISA的高灵

2、敏性的高灵敏性 抗体结合抗原的适应性：抗体结合抗原的适应性：FabFabCDRCDR 抗抗-HIV-HIV 初筛试验初筛试验 抗抗-HIV-HIV 确诊试验确诊试验CLVLVHCH1CH2CH3V区区FabFab段段FcFc段段s-ss-ss-ss-sCDR1CDR3CDR2 抗体结构简图抗体结构简图IgMIgM是五聚体，与抗原具有是五聚体，与抗原具有5 5或或1010价结合力。价结合力。FabFab：fragment antigen-binding fragment antigen-binding CDRCDR：complementarity determining region compl

3、ementarity determining region FabFab段段抗体结合抗原的适应性：抗体结合抗原的适应性：FabFabCDRCDR抗体产生过程简图抗体产生过程简图间接间接ELISAELISA检测抗体检测抗体1.抗原包被抗原包被2.封闭封闭3.待测血清待测血清4.酶标二抗酶标二抗5.TMB显色显色6.2M H2SO47.OD450E EEEEE+Substrate TMB抗抗-IgG-IgG抗抗-IgA-IgA抗抗-IgM-IgMIgGIgGIgAIgAIgMIgM抗体的粘附特性抗体的粘附特性00.501.001.502.00原倍原倍 10100 1000 10000血清稀释倍数血

4、清稀释倍数OD450间接间接ELISAELISA，无抗原包被，无抗原包被间接法间接法ELISAELISA检测抗体，灵敏，但容易出现假阳性检测抗体，灵敏，但容易出现假阳性捕捉法捕捉法ELISAELISA检测检测IgMIgM抗体抗体1.抗抗mu链抗体包被链抗体包被2.封闭封闭3.待测血清待测血清4.酶标抗原（特异性）酶标抗原（特异性）5.TMB显色显色6.2M H2SO47.OD450CLVLVHCH1CH2CH3V区区s-ss-ss-ss-s 敏感性较间接法低，但特异性强敏感性较间接法低，但特异性强230例普通人群(%)乙型肝炎病毒 HBV颗粒IgG，包被抗原，酶标二抗2061 cactcagg

5、ca agctgttctg tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc抗-HAV IgG：IgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG通常不用于诊断。不同试剂检测结果偏差很大，尤其在血清流行病学调查。点突变对459-607多肽二聚体的影响HAV感染后人体抗体应答HEV病原学检测与甲肝类似GBV-C，所谓庚型肝炎病毒，不引起肝损，不是肝炎病毒见于急性感染或慢性携带者急性发作EB病毒、巨细胞病毒等可引起肝损，但以脏器损伤为主，不称肝炎病毒October 2008急性戊肝病人抗-HEV IgM和IgG应答抗-HAV IgG 阳性E

6、LISAELISA检测抗原检测抗原1.抗体包被抗体包被2.封闭封闭3.待测血清待测血清4.酶标抗体酶标抗体5.TMB显色显色6.2M H2SO47.OD450E EEEEE+Substrate TMB 包被抗体与酶标抗体识别的免疫表位必须不同包被抗体与酶标抗体识别的免疫表位必须不同病毒性肝炎病毒性肝炎甲型甲型乙型乙型丙型丙型丁型丁型戊型戊型Hepatitis A Virus,HAVHepatitis A Virus,HAVHepatitis B Virus,HBVHepatitis B Virus,HBVHepatitis C Virus,HCVHepatitis C Virus,HCVHep

7、atitis D Virus,HDVHepatitis D Virus,HDVHepatitis E Virus,HEVHepatitis E Virus,HEV消化道消化道血液血液消化道消化道感染途径感染途径血液血液血液血液病原学病原学病程分型病程分型急性急性急性急性,慢性慢性急性急性,慢性慢性急性急性,慢性慢性急性急性 GBV-CGBV-C，所谓庚型肝炎病毒，所谓庚型肝炎病毒，不引起肝损，不引起肝损，不是肝炎病毒不是肝炎病毒 EBEB病毒、巨细胞病毒病毒、巨细胞病毒等可引起肝损，但以脏器损伤为主，等可引起肝损，但以脏器损伤为主，不称肝炎病毒不称肝炎病毒病毒性肝炎的病原诊断病毒性肝炎的病原诊

8、断 根据临床表现无法确定病原诊断根据临床表现无法确定病原诊断 依赖实验室检查依赖实验室检查血清学方法：血清血清学方法：血清+免疫技术检测抗原或抗体免疫技术检测抗原或抗体分子生物学：分子生物学：酶免疫测定：酶免疫测定：enzyme immunoassay,EIAenzyme immunoassay,EIA 酶联免疫吸附测定：酶联免疫吸附测定：enzyme-linked enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA immunosorbent assay,ELISA 分子杂交：同位素或其他物质标记已知分子杂交：同位素或其他物质标记已知DNADNA或或cDNAcDN

9、A，即，即探针，与待测标本中的核酸互补，特异性结合。淘汰探针，与待测标本中的核酸互补，特异性结合。淘汰 聚合酶链反应：聚合酶链反应：polymerase chain reactionpolymerase chain reaction，PCRPCR普普遍使用遍使用甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒 HAVHAV 无包膜无包膜RNARNA病毒：抗原种类少病毒：抗原种类少 正链正链RNARNA，7.4 kb7.4 kb HAVHAV抗原只有一种，即衣壳蛋白；难以测到，不开展抗原只有一种，即衣壳蛋白；难以测到，不开展 特异性抗体：抗特异性抗体：抗-HAV IgG,IgM-HAV IgG,IgM，保护性抗体；常用

10、，保护性抗体；常用 HAV RNAHAV RNA：RT-PCRRT-PCR检测，但阳性率低，仅用于研究检测，但阳性率低，仅用于研究0 02 24 46 68 810101212 抗甲肝抗体浓度抗甲肝抗体浓度感染后周数感染后周数病毒血症病毒血症大便排病毒大便排病毒转氨酶升高期转氨酶升高期症状期症状期IgMIgMIgGIgGHAVHAV感染后人体抗体应答感染后人体抗体应答 抗抗-HAV IgM-HAV IgM：感染后：感染后3 3周即可阳性，周即可阳性，1-31-3月后转阴，近期或急性感染。月后转阴，近期或急性感染。抗抗-HAV IgG-HAV IgG：IgMIgM产生后数天即可阳性，存在数十年，

11、单纯阳性很可产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG-HAV IgG通常不用于诊断。通常不用于诊断。甲型肝炎诊断流程甲型肝炎诊断流程同时检测抗同时检测抗HAV IgMHAV IgM和和IgGIgG时：时：4 4种情况种情况仅检测抗仅检测抗-HAV IgM-HAV IgM时时甲型肝炎甲型肝炎抗抗-HAV IgM-HAV IgM 阳性阳性抗抗-HAV IgG-HAV IgG 阳性阳性甲型肝炎甲型肝炎1.1.2.2.既往感染，对甲肝有免疫力既往感染，对甲肝有免疫力排除甲肝，而且为易感者排除甲肝，而且为易感者抗抗-HAV IgM-

12、HAV IgM 阴性阴性抗抗-HAV IgG-HAV IgG 阳性阳性抗抗-HAV IgM-HAV IgM 阴性阴性抗抗-HAV IgG-HAV IgG 阴性阴性3.3.阳性阳性阴性阴性排除排除甲型肝炎诊断流程甲型肝炎诊断流程同时检测抗同时检测抗HAV IgMHAV IgM和和IgGIgG时：时：4 4种情况种情况甲型肝炎早期甲型肝炎早期或或IgMIgM假阳性假阳性1-21-2周后复查周后复查甲型肝炎甲型肝炎甲型肝炎甲型肝炎IgM IgM 假阳性假阳性排除甲型肝炎排除甲型肝炎抗抗-HAV IgM-HAV IgM 阳性阳性抗抗-HAV IgG-HAV IgG 阴性阴性IgM IgM 阳性阳性Ig

13、G IgG 阳性阳性IgM IgM 阴性阴性IgG IgG 阳性阳性IgM IgM 阳性阳性IgG IgG 阴性阴性4.4.乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒 HBVHBV颗粒颗粒 完整完整HBVHBV：DaneDane particle particle；球形，；球形，42 nm42 nm，双层壳膜结构，双层壳膜结构 小球形颗粒：小球形颗粒：22 nm22 nm，乙肝表面抗原（，乙肝表面抗原（hepatitis B surface hepatitis B surface antigen,antigen,HBsAgHBsAg）丝状丝状(管状管状)颗粒：颗粒：直径直径22 nm22 nm，长短不等，长短不

14、等，HBsAgHBsAg18.718.7万倍万倍2020万倍万倍2525万倍万倍 HBVHBV双层壳膜结构双层壳膜结构，外层是，外层是HBsAgHBsAg，内层是，内层是HBcAgHBcAgHBVHBV基因与基因产物基因与基因产物pre-S1pre-S1pre-S2pre-S2ORF SORF SORF PORF PORF XORF XORF CORF Cpre-Cpre-C+-5 55 5HBsAgHBsAgPolymerase:Polymerase:DNA polymeraseDNA polymeraseRNase HRNase HReverse transcriptaseReverse

15、transcriptaseothersothers HBxAgHBxAgHBcAgHBcAgHBeAgHBeAgpre-S1pre-S1pre-S2pre-S2HBVHBV主要结构示意图主要结构示意图HBsAgHBsAgHBcAgHBcAgHBV DNAHBV DNA HBeAgHBeAg不是病毒的结构成份不是病毒的结构成份HBV PreC/CHBV PreC/C基因序列基因序列1814 atgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgtt catgtcctac 1861 tgttcaagcc tccaagctgt gccttggggg gctttgggac atg

16、gacattg 1911 accactataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 1961 tttgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct2011 ctatcgagag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag 2061 cactcaggca agctgttctg tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc 2111 tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagt

17、agtcgg2161 ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttggggtttc 2211 acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa ctgttctaga gtatttggtg 2261 tcttttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc 2311 ccctatctta tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca2361 ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag gtctca

18、atcg 2411 ccgcgtcgca gaagatctaa atctcgggaa tctcaatgtt agMQLFHLCLII SCSCPTVQAS KLCLGGLWDM DIDHYKEFGA SVELLSFLPF DFFPSIRDLL DTASALYREA LESPEHCSPH HTALRQAVLC WGELMNLATW VGSNLEDPAS RELVVGYVNV NMGLKIRQLL GFHISCLTFG RETVLEYLVS FGVWIRTPPA YRPPNAPILS TLPETTVVRR RGRSPRRRTP SPRRRRSQSP RRRRSKSRES QC 147-149HBV

19、 Pre C/C HBV Pre C/C 编码编码 HBcAgHBcAg/HBeAgHBeAgHBcAg:21.5 kDHBcAg:21.5 kDHBeAg:15.5 kDHBeAg:15.5 kD其他病毒复制过程中，缺乏类似特性，不释放游离抗原，故通常不检测抗原，而通过检测特异性抗体而诊断。抗-HAV IgM 阴性HBeAg不是病毒的结构成份SDS-PAGE电泳结果排除戊肝，而且为易感者HBV双层壳膜结构，外层是HBsAg，内层是HBcAg国产抗-HEV试剂盒所用抗原抗-HEV IgG：双份血清抗-HEV检测试剂质量差异很大(国外)抗体的粘附特性，特别是IgM抗体Ch1375(Sar-55,

20、1)同时检测抗HAV IgM和IgG时：4种情况抗-HEV IgG 阳性酶联免疫吸附测定：enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA球形，42 nm，双层壳膜结构HBVHBV抗原抗原5 53 35 53 342 nm42 nmHBsAgHBsAgHBcAgHBcAgHBV DNAHBV DNAHBeAgHBeAg不是不是HBVHBV本身的成分本身的成分是是HBcAgHBcAg的裂解产物的裂解产物能释放到细胞外能释放到细胞外外周血能测到外周血能测到能释放到细胞外能释放到细胞外外周血能测到外周血能测到不能释放到细胞外不能释放到细胞外外周血不能测到外周血不能测到外

21、周血无游离外周血无游离HBV DNAHBV DNA检测时先裂解检测时先裂解HBVHBVHBVHBV示意图示意图HBVHBV抗原抗原5 53 35 53 342 nm42 nmHBsAgHBsAgHBcAgHBcAgHBV DNAHBV DNAHBeAgHBeAg不是不是HBVHBV本身的成分本身的成分是是HBcAgHBcAg的裂解产物的裂解产物能释放到细胞外能释放到细胞外外周血能测到外周血能测到能释放到细胞外能释放到细胞外外周血能测到外周血能测到不能释放到细胞外不能释放到细胞外外周血不能测到外周血不能测到外周血无游离外周血无游离HBV DNAHBV DNA检测时先裂解检测时先裂解HBVHBVH

22、BVHBV示意图示意图 HBVHBV携带者肝脏每天释放携带者肝脏每天释放101010121012病毒病毒 血液血液HBsAgHBsAg是是HBVHBV的的10001000001000100000倍倍HBVHBV编码抗原特点编码抗原特点HBsAgHBsAg抗抗-HBs-HBs HBsAg+HBsAg+，有传染性，有传染性 HBsAg+HBsAg+和和HBeAg+HBeAg+，传染性强，传染性强 HBsAg HBsAg-，无传染性，无传染性，除隐匿性感染或变异外除隐匿性感染或变异外 抗抗-HBs+-HBs+，10 mIU/ml10 mIU/ml，有保护力，有保护力HBeAgHBeAg抗抗-HBe-

23、HBe抗抗-HBc-HBc乙型肝炎病原学检测乙型肝炎病原学检测 HBV DNAHBV DNA有条件的开展有条件的开展抗病毒治疗考核疗效抗病毒治疗考核疗效乙肝血清学检测结果的意义乙肝血清学检测结果的意义HBsAg抗抗-HBsHBeAg抗抗-HBe抗抗-HBc临床意义临床意义+-+-+感染、传染性强感染、传染性强+-+感染、有传染性感染、有传染性+-+-感染、有传染性感染、有传染性+-+感染、有传染性感染、有传染性+-+-感染、传染性强感染、传染性强+/-+/-+/-+/-+/-+/-感染、有传染性、病毒感染、有传染性、病毒可能变异可能变异+-感染潜伏期、有传染性感染潜伏期、有传染性+-接种疫苗后

24、、无传染性接种疫苗后、无传染性HBsAg抗抗-HBsHBeAg抗抗-HBe抗抗-HBc临床意义临床意义-+-+既往感染已恢复、有保护力既往感染已恢复、有保护力-+-+既往感染已恢复、有保护力既往感染已恢复、有保护力-+-+-既往感染已恢复、有保护力既往感染已恢复、有保护力-+-接种疫苗或既往感染已恢复、接种疫苗或既往感染已恢复、有保护力有保护力-+既往感染已恢复、无保护力既往感染已恢复、无保护力-+-既往感染已恢复、无保护力既往感染已恢复、无保护力-+既往感染已恢复、无保护力既往感染已恢复、无保护力-既往无感染、易感人群既往无感染、易感人群乙肝血清学检测结果的意义乙肝血清学检测结果的意义为什么

25、可通过检测外周血抗原诊断为什么可通过检测外周血抗原诊断HBVHBV感染？感染？HBeAgHBeAg能释放到细胞外能释放到细胞外比较容易测到比较容易测到 HBsAgHBsAg能释放到细胞外能释放到细胞外可测到可测到 HBVHBV携带者肝脏每天释放携带者肝脏每天释放101010121012病毒病毒 血液血液HBsAgHBsAg是是HBVHBV的的10001000001000100000倍倍 其他病毒复制过程中，缺乏类似特性，不释放游离抗原，其他病毒复制过程中，缺乏类似特性，不释放游离抗原，故通常不检测抗原，而通过检测特异性抗体而诊断。故通常不检测抗原，而通过检测特异性抗体而诊断。以上原因，决定了诊

26、断以上原因，决定了诊断HBVHBV感染可通过检测病毒抗原。感染可通过检测病毒抗原。容易测到容易测到抗抗-HBc-HBc的意义的意义 抗抗-HBc IgG-HBc IgG：长期存在，阳性时如：长期存在，阳性时如HBsAgHBsAg阴性，既往感染阴性，既往感染 抗抗-HBc IgM-HBc IgM：短期存在，：短期存在，阳性时，通常阳性时，通常HBsAgHBsAg也阳性也阳性；见于急性感染或慢性携带者急性发作见于急性感染或慢性携带者急性发作 实际工作中，抗实际工作中，抗-HBc-HBc阳性具有传染性阳性具有传染性 基本不正确基本不正确 抗抗-HBc IgM-HBc IgM具有传染性正确具有传染性正

27、确 目前检测的抗目前检测的抗-HBc-HBc是总抗体，包括是总抗体，包括IgGIgG、IgMIgM等，只要等，只要IgGIgG阳阳性，抗性，抗-HBc-HBc即阳性；多数情况下，抗即阳性；多数情况下，抗-HBc-HBc阳性仅是阳性仅是 IgGIgG抗体抗体阳性。阳性。正确正确HBsAgHBsAg阳性具有传染性阳性具有传染性HBsAg(HBsAg()HBeAg(+)HBeAg(+)阳性阳性HBVHBV携带者携带者March 2008October 2008January 2009HBsAg(IU/ml)-(0.01)-(0.00)抗抗-HBs(mIU/ml)+(5356)+(11578)HBeA

28、g+(72.78)+(72.89)抗抗-HBe-(4.33)-(4.28)抗抗-HBc+(11.89)+(15.91)抗抗-HBc IgMnot done-ALT(U/L)21.024.221.5HBV DNA(copies/ml)not done+(491)+(370)HBsAg(HBsAg()HBeAg(+)HBeAg(+)阳性携带者新的阳性携带者新的S S基因变异基因变异PCRPCR产物测序产物测序克隆后测序克隆后测序pre S2 geneHBsAg(HBsAg()HBeAg(+)HBeAg(+)阳性携带者前阳性携带者前S2S2基因序列基因序列PCRPCR产物测序产物测序克隆后测序克隆后

29、测序HBsAg(HBsAg()HBeAg(+)HBeAg(+)阳性阳性HBVHBV携带者携带者IF 3.124具有研究价值的具有研究价值的HBVHBV标本标本HBsAgHBsAg抗抗-HBs-HBsHBeAgHBeAg抗抗-HBe-HBe抗抗-HBc-HBc研究内容研究内容+/-+/-+/-+/-+/-+/-变异变异+-转归转归+-+-转归转归+-+-？抗？抗c c阴性阴性-+-+-？抗？抗c c阴性阴性-+-？抗？抗c c阴性阴性*-+-？抗？抗c c阴性阴性*未接种疫苗，即自然感染除外。未接种疫苗，即自然感染除外。丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒 HCVHCVHCV 30-60 nmHCV 30-

30、60 nm有有包膜的包膜的RNARNA病毒病毒，核心含有，核心含有核心蛋白和核心蛋白和RNARNA单链正义单链正义HBVHBV HCVHCV抵抗力弱，且抵抗力弱，且RNARNA容易降解，检测核酸时，标本容易降解，检测核酸时，标本需在需在3030分钟内分离血清，分钟内分离血清，-80-80 C C保存。保存。抗-HEV与不形成二聚体的截短肽几乎无反应性抗-HAV IgG：IgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG通常不用于诊断。缺陷病毒，必须有HBsAgCh1375(Sar-55,1)包被抗体与酶标抗体识别的免疫表位必须不同属于family He

31、peviridae,genus Hepevirus1814 atgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgtt catgtcctacEB病毒、巨细胞病毒等可引起肝损，但以脏器损伤为主，不称肝炎病毒新的HEV发现：兔HEV王佑春等同时检测抗HAV IgM和IgG时：4种情况IgG，包被抗原，酶标二抗2011 ctatcgagag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag国产抗-HEV试剂盒所用抗原针对HCV所有抗原的抗体都没有证实有中和作用国产抗-HEV试剂盒所用抗原Lipid layerLipid layer脂质层脂质

32、层Core,Core,核心蛋白核心蛋白E1,E1,包膜蛋白包膜蛋白1 1E2,E2,包膜蛋白包膜蛋白2 2RNA,RNA,病毒核酸病毒核酸直径直径30-60 nm30-60 nm结构蛋白结构蛋白HCVHCV结构简图结构简图糖基化蛋白糖基化蛋白HCVHCV示意图示意图HCVHCV基因与基因产物基因与基因产物hypervariable region 1,HVR1hypervariable region 1,HVR1Untranslated Region,UTR Untranslated Region,UTR Noncoding region,NCR Noncoding region,NCR 针对针

33、对HCVHCV所有所有抗原的抗体都抗原的抗体都没有没有证实有证实有中和作用中和作用HVR138 clones15 sequencesHCVHCV高度变异高度变异HVR1HVR1 抗原检测抗原检测 HCV core:HCV core:仅用于研究仅用于研究 抗抗-HCV IgM-HCV IgM：一般不开展，阳性率低：一般不开展，阳性率低 HCV RNAHCV RNA：有条件的开展；抗病毒治疗考核疗效：有条件的开展；抗病毒治疗考核疗效 抗抗-HCV IgG-HCV IgG：开展开展，(+)(+)通常表示有通常表示有HCVHCV感染感染HCVHCV病原学诊断病原学诊断针对针对HCVHCV所有所有抗原的

34、抗体都抗原的抗体都没有没有证实有证实有中和作用中和作用 抗抗-HCV IgM-HCV IgM：一般不开展：一般不开展 抗抗-HCV IgG-HCV IgG：开展开展，90-9590-95的的(+)(+)提示提示HCVHCV感染感染HCVHCV病原学诊断抗病原学诊断抗-HCV-HCV检测检测包被抗原包被抗原1st1st代代3rd3rd代代2nd2nd代代50-75%50-75%90-95%90-95%95-99%95-99%阳性率阳性率丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒 HDVHDV Deltavirus genusDeltavirus genus中的唯一病毒中的唯一病毒HDV,36 nmHDV,36 n

35、m HDV RNA,1.7 kbHDV RNA,1.7 kb 缺陷病毒，必须有缺陷病毒，必须有HBsAgHBsAg HDAgHDAg：仅用于研究：仅用于研究 抗抗-HD IgM-HD IgM：()近期感染近期感染 抗抗-HD IgG-HD IgG：()感染感染 HDV RNAHDV RNA：仅用于研究：仅用于研究HDVHDV病原学检测病原学检测仅在仅在HBsAgHBsAg阳性人群中检测才有意义：阳性人群中检测才有意义：戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒 HEVHEV属于属于family family HepHepe eviridae,genus Hepevirusviridae,genus Hepevi

36、rusHEV,30-32 nmHEV,30-32 nm 无包膜：抗原种类少无包膜：抗原种类少 新的新的HEVHEV发现：兔发现：兔HEVHEV王佑春等王佑春等HEVHEV基因及其蛋白基因及其蛋白ORF1ORF3？ORF253核衣壳核衣壳CapsidCapsid非结构蛋白非结构蛋白结构蛋白结构蛋白主要抗原决定簇主要抗原决定簇中和免疫中和免疫459607 核酸：核酸：单链正义单链正义RNARNA，7.2 kb7.2 kb02468101214转氨酶升高期转氨酶升高期症状期症状期IgMIgG病毒血症病毒血症大便排病毒大便排病毒 抗戊肝抗体浓度抗戊肝抗体浓度感染后周数感染后周数HEVHEV感染后人体抗

37、体应答与感染后人体抗体应答与HAVHAV类似类似 抗抗-HEV IgM-HEV IgM：感染后：感染后3 3周即可阳性，周即可阳性，1-31-3月后转阴，近期或急性感染。月后转阴，近期或急性感染。抗抗-HEV IgG-HEV IgG：IgMIgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG-HAV IgG通常不用于诊断。通常不用于诊断。HEVHEV抗原：一般不开展，仅用于研究抗原：一般不开展，仅用于研究HEVHEV病原学检测病原学检测与甲肝类似与甲肝类似 抗抗-HEV IgM-HEV

38、 IgM：()近期感染近期感染 抗抗-HEV IgG-HEV IgG：双份血清：双份血清 HEV RNAHEV RNA：一般不开展，仅用于研究：一般不开展，仅用于研究HEVHEV病原诊断抗病原诊断抗-HEV-HEV同时检测抗同时检测抗HAV IgMHAV IgM和和IgGIgG时：时：4 4种情况种情况仅检测抗仅检测抗-HEV IgM-HEV IgM时时戊型肝炎戊型肝炎抗抗-HEV IgM-HEV IgM 阳性阳性抗抗-HEV IgG-HEV IgG 阳性阳性戊型肝炎戊型肝炎1.1.2.2.既往感染，对戊肝有免疫力既往感染，对戊肝有免疫力排除戊肝，而且为易感者排除戊肝，而且为易感者抗抗-HEV

39、 IgM-HEV IgM 阴性阴性抗抗-HEV IgG-HEV IgG 阳性阳性抗抗-HEV IgM-HEV IgM 阴性阴性抗抗-HEV IgG-HEV IgG 阴性阴性3.3.阳性阳性阴性阴性排除排除同时检测抗同时检测抗HAV IgMHAV IgM和和IgGIgG时：时：4 4种情况种情况戊型肝炎早期戊型肝炎早期或或IgMIgM假阳性假阳性1-21-2周后复查周后复查戊型肝炎戊型肝炎戊型肝炎戊型肝炎IgM IgM 假阳性假阳性排除戊型肝炎排除戊型肝炎抗抗-HEV IgM-HEV IgM 阳性阳性抗抗-HEV IgG-HEV IgG 阴性阴性IgM IgM 阳性阳性IgG IgG 阳性阳性I

40、gM IgM 阴性阴性IgG IgG 阳性阳性IgM IgM 阳性阳性IgG IgG 阴性阴性4.4.HEVHEV病原诊断抗病原诊断抗-HEV-HEV抗抗-HEV-HEV检测试剂质量差异很大检测试剂质量差异很大(国外国外)方方法法种类种类抗抗原原ORFORF来源来源病毒病毒+血血666月月2020例例-血清血清2222例例1 1EIAEIAR R2 2昆虫昆虫巴基巴基9 918180 02 2EIAEIAR R2 2昆虫昆虫缅甸缅甸9 920200 03 3WBWBR R2 2昆虫昆虫缅甸缅甸9 920201 61 64 4WBWBR R2,32,3大肠大肠中国中国8 819190 10 15

41、 5EIAEIAR R2 2大肠大肠缅甸缅甸 9 919190 06 6EIAEIAR R2,32,3大肠大肠缅缅,墨墨5 514140 07 7EIAEIAR R2,32,3大肠大肠缅缅,墨墨9 917170 08 8EIAEIAR R2,32,3大肠大肠缅缅,墨墨6 614 114 10 09 9EIAEIAS S3 3缅甸缅甸1 11 15 25 21010EIAEIAS S2 2缅甸缅甸7 17 13 63 60 011 11EIAEIAS S3 3缅缅,墨墨2 22 20 01212EIAEIAS S2,32,3缅缅,墨墨6 610100 0Hepatology 1998;27:85

42、7-861.Hepatology 1998;27:857-861.1212种检测方法早期康复期血清抗种检测方法早期康复期血清抗-HEV-HEV滴度滴度Hepatology 1998;27:857-861.Hepatology 1998;27:857-861.WBWB昆虫昆虫大肠杆菌大肠杆菌合成肽合成肽抗抗-HEV IgG-HEV IgG诊断试剂阳性率比较诊断试剂阳性率比较(国内外国内外)厂商厂商结果结果明确人群明确人群 (符合率符合率%)%)总符合总符合率率%230230例普通人例普通人群群 (%)(%)患者患者2424例例非患者非患者3030例例万泰万泰+23(95.83)23(95.83)

43、1(3.33)1(3.33)96.3096.307373(31.74)(31.74)-1(4.17)1(4.17)29(96.67)29(96.67)高达高达+21(21(87.5087.50)0 094.4494.4440 40(17.39)(17.39)-3(12.50)3(12.50)30(100)30(100)华美华美+21(21(87.5087.50)1(3.33)1(3.33)92.5992.5955 55(23.91)(23.91)-3(12.5)3(12.5)29(96.67)29(96.67)GeneLabGeneLab+16(16(66.6766.67)0 085.1885

44、.1818 18(7.83)(7.83)-8(33.33)8(33.33)30(100)30(100)科华科华+11(45.83)11(45.83)0 075.9375.938 8(3.48)(3.48)-13(54.17)13(54.17)30(100)30(100)不同试剂检测结果偏差很大，尤其在血清流行病学调查。不同试剂检测结果偏差很大，尤其在血清流行病学调查。中华实验和临床病毒学杂志 2007;21(1):59-61.抗抗-HEV IgM-HEV IgM 抗抗-HEV IgG-HEV IgG检测方法存在一定假阳性和假阴性检测方法存在一定假阳性和假阴性607-660ORF21-11145

45、8-607ORF3-EORF3-S112391123ORF36601主要抗原决定簇主要抗原决定簇GeneLabs GeneLabs 试剂的抗原，间接法试剂的抗原，间接法J Virol Methods 1992;38(1):17586.包被抗原包被抗原ORF2ORF31 1和和2 2型、合成肽和细菌表达型、合成肽和细菌表达灵敏度和特异性低灵敏度和特异性低ORF2ORF2衣壳蛋白，衣壳蛋白，72 kDa72 kDa国产抗国产抗-HEV-HEV试剂盒所用抗原试剂盒所用抗原 万泰公司抗原：万泰公司抗原：IgMIgM，包被，包被mumu链，酶标抗原链，酶标抗原IgGIgG，包被抗原，酶标二抗，包被抗原，

46、酶标二抗3946061660 特异性高特异性高灵敏度较高灵敏度较高458-607 高达试剂：合成肽？高达试剂：合成肽？同时包括了同时包括了ORF2 ORF2 和和ORF3ORF3多肽抗原，具体不详？多肽抗原，具体不详？首都公共卫生首都公共卫生2007;1(4):168-170.华美公司和科华公司：华美公司和科华公司：灵长动物实验感染后灵长动物实验感染后 抗抗-HEV IgM-HEV IgM和和IgGIgG应答应答Yu,et al.CGLI 2003急性戊肝病人抗急性戊肝病人抗-HEV IgM-HEV IgM和和IgGIgG应答应答Seriwatana,et al.CGLI 2002如何提高戊型

47、肝炎诊断的准确性？如何提高戊型肝炎诊断的准确性？急性急性HEVHEV感染，发病时抗感染，发病时抗-HEV IgM-HEV IgM 和和 IgG IgG 通常同时阳性通常同时阳性确诊确诊 同时检测抗同时检测抗-HEV IgG-HEV IgG和和IgMIgMIgGIgGIgMIgMIgGIgGIgMIgMIgGIgGIgMIgMIgGIgGIgMIgM1 12 2周后周后复查复查排除排除既往感染既往感染IgGIgGIgMIgMIgGIgGIgMIgMIgGIgGIgMIgM确诊确诊假阳性假阳性假阳性假阳性Ch1374(Sar-55,I)A450Ch1375(Sar-55,1)458-6071660

48、112-6070.00.53.03.50246810 13 15 17112-607458-607475-607475-607Ch1374(Sar-55,1)感染后周数感染后周数感染后周数感染后周数0.00.51.01.52.02.53.03.50246810 13 15 17112-607458-607475-607A4501.01.52.02.5 利用利用抗原主要决定簇多肽抗原主要决定簇多肽的的高反应性高反应性检测阳性标本检测阳性标本 利用利用抗原主要决定簇截短肽抗原主要决定簇截短肽的的无反应性无反应性排除假阳性排除假阳性如何提高戊型肝炎诊断的准确性？如何提高戊型肝炎诊断的准确性？表达载体

49、HEV ORF21660459459607594ORF2 ORF2 多肽的蛋白表达多肽的蛋白表达472607将重组质粒导入大肠杆菌将重组质粒导入大肠杆菌1 2 3 1 2 3 1 2 3 459-607 459-594 472-607kDa362216ORF2多肽多肽大肠杆菌表达大肠杆菌表达ORF2多肽多肽SDS-PAGE电泳结果电泳结果459-607459-594472-607459-607459-594472-607kDa36221650二聚体二聚体单体单体SDS-PAGE加样缓冲液加样缓冲液煮沸煮沸 5 min5 min不加热不加热ORF2多肽的多肽的二聚体特性二聚体特性SDS-PAGE

50、电泳结果电泳结果3622二聚体二聚体单体单体抗抗-His6-His6抗抗-HEV-HEV抗抗-HEV-HEV459-607459-594472-607459-607459-594472-607459-607459-594472-607抗抗-HEV-HEV仅与仅与ORF2ORF2多肽二聚体反应多肽二聚体反应1660459459607594472607+-kDaWestern blotting 蛋白免疫印迹结果蛋白免疫印迹结果ORF2HBsAg+和HBeAg+，传染性强间接ELISA检测抗体本室和万泰试剂结果抗-HEV结果比较230例普通人群(%)正确HBsAg阳性具有传染性实际工作中，抗-HBc