乙肝定量检测意义及新型检测技术的进展课件.ppt

1、一、乙肝病毒病原学、流行病学及常见检测指一、乙肝病毒病原学、流行病学及常见检测指标标二、乙肝五项定量检测意义二、乙肝五项定量检测意义三、乙肝五项常见检测模式解释三、乙肝五项常见检测模式解释1.1 乙肝病毒的流行现状；乙肝病毒的流行现状；1.2 乙肝病毒的形态和结构；乙肝病毒的形态和结构；1.3 乙肝的传播途径和高危人群；乙肝的传播途径和高危人群；我国我国HBVHBV感染流行现状感染流行现状1.1.31.1.3乙肝亚型的地理分布乙肝亚型的地理分布 资料来源：骆抗先，乙型肝炎基础和临床第二版资料来源：骆抗先，乙型肝炎基础和临床第二版vayw多见于非洲、东地中海、中东及巴基多见于非洲、东地中海、中东

2、及巴基斯坦；斯坦；vadw多见于北欧及美洲；多见于北欧及美洲；adr多见于东南多见于东南亚及远东，亚及远东，adw及及adr多见于印尼、马来多见于印尼、马来西亚、新几内亚及泰国西亚、新几内亚及泰国 v我国则具有一定的民族性，我国则具有一定的民族性，汉族人以汉族人以adr为主，为主，adw次之次之v蒙古族、维吾尔族、回族等兄弟民族几蒙古族、维吾尔族、回族等兄弟民族几乎都是乎都是ayw亚型亚型，ayr亚型极其少见，而亚型极其少见，而adr亚型几乎没有。亚型几乎没有。1.2.1 HBV的基本（电镜）结构的基本（电镜）结构1.2.2 HBV的基因结构的基因结构1.2.1HBV1.2.1HBV形态结构形

3、态结构大球形颗粒大球形颗粒（Dane颗粒）颗粒）管形颗粒管形颗粒小球形颗粒小球形颗粒HBsAgHBcAgDNAP（外膜蛋白）（外膜蛋白）（核衣壳蛋白）（核衣壳蛋白）HBV DNApre-s1pre-s2SP PC Cpre-cXHBV DNA 3.2 kbpre-S1 pre-S1蛋白蛋白pre-S2 pre-S2蛋白蛋白S HBsAgpre-C HBeAgC HBcAgP DNAPX HBxAgHBsAgpre-S2pre-S1血液传播、血液传播、（输血、血制品、（输血、血制品、医疗器械等）医疗器械等）日常生活日常生活（伤口、共用刀具、（伤口、共用刀具、消化道粘膜破损或消化道粘膜破损或溃疡等

4、）溃疡等）母婴母婴 传播传播性传播性传播v母亲是母亲是HBV感染者的婴儿感染者的婴儿v乙肝患者的家庭成员乙肝患者的家庭成员v吸毒者吸毒者v监狱犯人监狱犯人v性传播疾病病人性传播疾病病人v血液透析病人血液透析病人v医护人员医护人员1.4.1 HBVHBV血清标志物及其临床意义血清标志物及其临床意义1.4.2 1.4.2 介绍几个临床乙肝检测的概念介绍几个临床乙肝检测的概念1.4.3 1.4.3 临床常见乙肝血清标志物反映模式临床常见乙肝血清标志物反映模式v肝功能肝功能(主要为丙氨酸氨基转移酶主要为丙氨酸氨基转移酶(ALT)v乙肝病毒感染标志物乙肝病毒感染标志物 HBV-DNA 两对半两对半:抗原

5、抗原 抗体抗体 外膜外膜 HBsAg HBsAb 核壳分泌蛋白核壳分泌蛋白 HBeAg HBeAb 核壳结构蛋白核壳结构蛋白HBcAg HBcAbv 肝组织病理学检查肝组织病理学检查v谷丙转氨酶（谷丙转氨酶（ALT）主要存在于肝细胞中。当主要存在于肝细胞中。当肝脏发生炎症、坏死时，肝脏发生炎症、坏死时，ALT就会从肝细胞内就会从肝细胞内大量释放入血，导致血清中大量释放入血，导致血清中ALT升高，因此升高，因此ALT升高是判断肝细胞损害的一个敏感指标。升高是判断肝细胞损害的一个敏感指标。v但是除了病毒性肝炎外，其它类型的肝炎或肝但是除了病毒性肝炎外，其它类型的肝炎或肝脏疾病，脏疾病，ALT也会升

6、高。也会升高。DNA是基因，因此是基因，因此HBV-DNA是是HBV的的遗传物质，当遗传物质，当HBV侵入肝细胞后，就会侵入肝细胞后，就会以以HBV-DNA为模板，合成新的为模板，合成新的HBV颗颗粒并释放入血，故粒并释放入血，故HBV-DNA是病毒复制是病毒复制的一个重要指标。的一个重要指标。肝组织病理学检查是肝组织病理学检查是“金标准金标准”：v 明确诊断明确诊断v 衡量肝脏炎症活动度衡量肝脏炎症活动度v 衡量纤维化程度衡量纤维化程度v 决定治疗方案，预测药物疗效决定治疗方案，预测药物疗效 对肝病而言对肝病而言肝组织学检查是比血清肝组织学检查是比血清ALT 更灵敏而精确的指标更灵敏而精确的

7、指标 抗原抗原 抗体（机体产生）抗体（机体产生）外膜外膜 HBsAg HBsAb核壳分泌蛋白核壳分泌蛋白 HBeAg HBeAb核壳结构蛋白核壳结构蛋白 HBcAg HBcAb DNA HBV-DNA（1）HBsAg出现时间：出现时间：HBV感染后感染后26个月（潜伏期）个月（潜伏期）持续时间：持续时间：急性自限性肝炎：急性自限性肝炎：6个月内可消失个月内可消失慢性肝炎或慢性慢性肝炎或慢性HBsAg携带者：可持续阳性携带者：可持续阳性曾用名：曾用名：HA、澳抗澳抗HBsAg 有抗原性而无传染性有抗原性而无传染性HBVS 基因基因整合整合肝细胞肝细胞DNA持续表达持续表达“空心汤团空心汤团”HB

8、sAgHBsAg 的亚型的亚型adradwayrayw长江以北长江以北长江以南长江以南新疆、西藏、内蒙等新疆、西藏、内蒙等出现时间：急性感染后期、出现时间：急性感染后期、HBsAg 消失后消失后和注射疫苗后正常的免疫应答者和注射疫苗后正常的免疫应答者抗抗-HBs为保护性抗体（中和抗体）为保护性抗体（中和抗体）其出现标志着其出现标志着HBV感染进入恢复期和注感染进入恢复期和注射乙肝疫苗后产生正常的免疫应答射乙肝疫苗后产生正常的免疫应答抗抗-HBs 对相同对相同 HBsAg亚型的亚型的HBV再感染有免再感染有免 疫力，但对不同亚型的疫力，但对不同亚型的HBV保护力不完全。保护力不完全。HBeAg是

9、是HBcAg的降解产物的降解产物HBV CHBV C基因基因前前C区区C 区区前前C/C 蛋白蛋白HBeAgHBcAg表表 达达切割、加工切割、加工分泌到细胞外分泌到细胞外HBeAg只存在于血清中只存在于血清中HBeAg是病毒复制和传染性的标志是病毒复制和传染性的标志血清血清HBeAg与与HBV DNA的含量成正相关，的含量成正相关，符合率达到符合率达到95%以上。以上。出现时间：随着出现时间：随着HBeAg的消失而出现的消失而出现抗抗-HBe的出现标志着病毒复制减少、传染性降低的出现标志着病毒复制减少、传染性降低抗抗-HBe阳性者中，阳性者中，16.3%30%左右左右HBV DNA仍阳性仍阳

10、性 可能与前可能与前C基因变异有关基因变异有关 易加重病情、易演变为肝硬化易加重病情、易演变为肝硬化-干扰素疗效亦较差干扰素疗效亦较差HBcAg主要存在于主要存在于HBV感染的肝细胞内或感染的肝细胞内或DANE颗粒颗粒 核心中，到血液中即被降解为核心中，到血液中即被降解为HBeAg。一般血清学方法检测不到一般血清学方法检测不到HBcAg，而只能检测到抗而只能检测到抗-HBc抗抗HBc-IgM：是是HBV近期感染或慢性感染者病毒活动的标志近期感染或慢性感染者病毒活动的标志抗抗HBc-IgG：凡凡“有过有过”HBV感染者均可阳感染者均可阳性性HBcAg的免疫原性最强的免疫原性最强持续时间：持续时间

11、：618个月个月可终身阳性可终身阳性HBsAg HBV感染，但未必是急性肝炎或者感染，但未必是急性肝炎或者 慢性病变活动的病原。慢性病变活动的病原。抗抗HBs 感染后免疫；对疫苗的免疫应答；或感染后免疫；对疫苗的免疫应答；或HBIG的被动免疫的被动免疫HBeAg 反映反映HBV复制，有病毒血症，血液高传染性复制，有病毒血症，血液高传染性抗抗HBe ALT持续正常者表示持续正常者表示HBV低复制或不复制，低复制或不复制，HBsAg (+)血液低传染性。血液低传染性。ALT波动者表示病毒变异。波动者表示病毒变异。抗抗HBc 低滴度表示过去感染；高滴度表示现行感染。低滴度表示过去感染；高滴度表示现行

12、感染。IgM抗抗HBc 高滴度表示急性或近期感染；高滴度表示急性或近期感染；活动性病变可出现低滴度。活动性病变可出现低滴度。1.4.2介绍几个概念：介绍几个概念：“两对半两对半”HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和和HBcAb 血清抗原血清抗原抗体转换率：抗体转换率：HBeAg 抗抗-HBe “转转 阴阴”常用指标常用指标：血清血清HBeAg抗原抗原抗体转换率抗体转换率 HBV DNA 阴转率阴转率v急性乙肝治疗中的具体监测急性乙肝治疗中的具体监测 v慢性无症状携带者（慢性无症状携带者（AsC）的动态观察）的动态观察v酶免或胶体金检测酶免或胶体金检测HBsAg（-）的）的HBV感感

13、染的结果分析染的结果分析 v注射乙肝疫苗后免疫效果（抗注射乙肝疫苗后免疫效果（抗-HBs浓度浓度的定量分析）的定量分析）v结合结合FQ-PCR-DNA诊断病情诊断病情急性乙型肝炎移行为AsC的过程图0510月份浓度HBsAg（ng/ml）HBeAg（NCU/ml）ALT IU/LHBV DNAHBcAbHBsAgHBeAgHBeAbHBsAb化学发光定量（化学发光定量（CLIA）检测）检测HBsAg灵敏度可达灵敏度可达0.05-0.1ng/ml，而酶标（，而酶标（ELISA）检测）检测HBsAg灵敏度是灵敏度是0.5-1.0ng/ml，胶体金（，胶体金（POCT）检测）检测HBsAg灵敏度是灵

14、敏度是1-5ng/ml也也就是说只有血清中的就是说只有血清中的HBsAg达到达到0.5-5ng/ml酶标或胶体金才酶标或胶体金才会呈阳性反应。会呈阳性反应。急性乙肝早期：急性乙肝早期：CLIA定量能及早检出定量能及早检出HBsAg，确证，确证HBV感染，几乎能与感染，几乎能与preS1同时检测，在病程观察中大大缩同时检测，在病程观察中大大缩短短“窗口期窗口期”时间，而酶标或胶体金在乙肝早期检测往往时间，而酶标或胶体金在乙肝早期检测往往HBsAg呈阴性。呈阴性。慢性乙肝：一些患者由于机体对慢性乙肝：一些患者由于机体对HBV包膜蛋白包膜蛋白(HBsAg)表达较低，酶标或胶体金检测可出现表达较低，酶

15、标或胶体金检测可出现HBsAg和抗和抗-HBs均阴性均阴性的情况，而的情况，而CLIA技术则可避免这些情况的出现，为正确判技术则可避免这些情况的出现，为正确判断病情提供依据断病情提供依据。病毒发生变异后，表达量较低，常规病毒发生变异后，表达量较低，常规ELISA或胶体金测或胶体金测不出抗原，而不出抗原，而CLIA定量具有极高的灵敏度，可发现并极有定量具有极高的灵敏度，可发现并极有可能同时检测出可能同时检测出HBsAg和抗和抗-HBs。注射乙肝疫苗后免疫效果（抗注射乙肝疫苗后免疫效果（抗-HBs浓度的定量分析）：浓度的定量分析）：v全程（全程（3针）免疫结束后针）免疫结束后1个月检测保护性抗个月

16、检测保护性抗-HBs的浓的浓度，据此值将乙肝疫苗接种者分为四种情况：度，据此值将乙肝疫苗接种者分为四种情况：v（1）无应答者：抗体浓度小于）无应答者：抗体浓度小于1mIU/ml，无抗体产生，无抗体产生或非特异性结合反应，约占接种者的或非特异性结合反应，约占接种者的5%，继续加大剂，继续加大剂量或更换疫苗厂家全程（量或更换疫苗厂家全程（3针）免疫注射；针）免疫注射；v（2）低应答者：抗体浓度为）低应答者：抗体浓度为1-10mIU/ml，保护作用比，保护作用比较弱，约占接种者的较弱，约占接种者的10%，须加强两针疫苗注射；，须加强两针疫苗注射；v（3）中应答者：抗体浓度为）中应答者：抗体浓度为10

17、-100mIU/ml，已有一定，已有一定的保护力，约占接种者的保护力，约占接种者65%，须加强一针疫苗注射；，须加强一针疫苗注射；v（4）高应答者：抗体浓度大于）高应答者：抗体浓度大于100mIU/mI，免疫效果，免疫效果最好，约占接种者最好，约占接种者20%，不需要加强注射。，不需要加强注射。v因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。vPCR基本知识：基本知识：1、反应五要素：、反应五要素：参加参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、反应的

18、物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和模板和Mg2+2、PCR反应条件为温度、时间和循环次数（变性温度与时间为反应条件为温度、时间和循环次数（变性温度与时间为9394lmin；退火与延伸；退火与延伸(复性复性)温度与时间温度与时间；55 2min；循环次数：循环次数：40次次3、PCR反应步骤：变性，退火和延伸反应步骤：变性，退火和延伸4、假阳性和假阴性、假阳性和假阴性5、血清、血清HBV-DNA荧光定量荧光定量PCR测定可以直接反映病毒复制状态测定可以直接反映病毒复制状态 6、不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内、不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态病毒状态 v结合结合PCR诊

19、断病情诊断病情 HBV-DNA阴性并不完全代表体内阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结合已被清除，结合“两对半两对半”各各项指标定量变化更能客观反映体内项指标定量变化更能客观反映体内HBV病毒状态，正确判断预后和治病毒状态，正确判断预后和治疗。如果疗。如果HBV-DNA阴性而阴性而HBsAg、HBeAg或抗或抗-HBe及抗及抗-HBc浓度均浓度均还较高，提示并未完全痊愈，有可能病毒再次出现复制状况，尚须密还较高，提示并未完全痊愈，有可能病毒再次出现复制状况，尚须密切关注。如果切关注。如果HBV-DNA阴性而阴性而HBsAg、HBeAg或抗或抗-HBe及抗及抗-HBc浓浓度均很低或阴性并持续一

20、段时间，提示可能完全痊愈，预后疗效良好。度均很低或阴性并持续一段时间，提示可能完全痊愈，预后疗效良好。（1）定量分析）定量分析HBsAg和抗和抗-HBs的浓度变化，的浓度变化，可以预见急性乙肝是否处于恢复期。如可以预见急性乙肝是否处于恢复期。如HBsAg浓度降低，抗浓度降低，抗-HBs的浓度逐渐升高，的浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展。反之，可说明病情正往恢复期发展。反之，HBsAg浓度处于较高水平或上升趋势，而抗浓度处于较高水平或上升趋势，而抗-HBs一一直处于较低水平，则容易发展为慢性乙肝或直处于较低水平，则容易发展为慢性乙肝或乙肝病毒携带者。在急性乙肝病毒携带者。在急性HBV恢复期

21、中约有恢复期中约有3%的个例可同时检出低水平的个例可同时检出低水平HBsAg和抗和抗-HBs，然后，然后HBsAg消失而抗消失而抗-HBs水平渐增高。水平渐增高。（2）定量分析）定量分析HBeAg和抗和抗-HBe的浓度变化，的浓度变化，可以反映病情变化和治疗效果。定量测定可以反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测能明确检测HBeAg向抗向抗-HBe转换的时期，转换的时期，即表现为即表现为HBeAg浓度下降和抗浓度下降和抗-HBe浓度升浓度升高的过程。高浓度的高的过程。高浓度的HBeAg还可间接提示还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。高浓度

22、的抗高浓度的抗-HBe一方面提示病情的好转，一方面提示病情的好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）可能而在某些时候（如肝功能指标很差）可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关，应进一步与肝坏死、肝硬化、肝癌有关，应进一步结合肝功生化指标如结合肝功生化指标如ALT、AST、BIL等进等进行综合判定。行综合判定。（3）抗）抗-HBc浓度的高低可以反映病毒感染浓度的高低可以反映病毒感染的状态。高浓度的抗的状态。高浓度的抗-HBc提示乙肝急性或提示乙肝急性或现行感染，常与现行感染，常与HBsAg并存，恢复期浓度并存，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗降低。慢性乙肝呈抗-HBc持续高浓度。而持续高浓度。而低浓度的抗低浓

23、度的抗-HBc一般为恢复期或既往感染，一般为恢复期或既往感染，常于抗常于抗-HBs并存，无肝损害或肝损害早已并存，无肝损害或肝损害早已静息。静息。（4）急性乙肝一般会在六个内病情缓解，甚）急性乙肝一般会在六个内病情缓解，甚至自愈。病情超过六个月仍未缓解者，多转至自愈。病情超过六个月仍未缓解者，多转为慢性化，但通过五项联合定量分析，再结为慢性化，但通过五项联合定量分析，再结合肝功指标和合肝功指标和HBV DNA的水平，即若表现的水平，即若表现为为HBeAg下降、抗下降、抗-HBe出现或渐升，出现或渐升，HBsAg和和HBV DNA血清水平降低，这是病变恢复血清水平降低，这是病变恢复的时相，可望在的时相，可望在1-2年病毒被清除而疾病痊愈；年病毒被清除而疾病痊愈；若若HBeAg和和HBV DNA 血清水平持续很高的血清水平持续很高的病人，预期可能保留慢性无症状携带（病人，预期可能保留慢性无症状携带（AsC）或慢性乙型肝炎。或慢性乙型肝炎。3.1常见九种模式常见九种模式3.2少见十六种模式少见十六种模式3.3罕见七种模式罕见七种模式乙肝五项定量检测模式解释乙肝五项定量检测模式解释.doc谢谢 谢谢 大家大家！