《生物免疫分析技术》课件.ppt

1、 ELISA的基本原理和方法的基本原理和方法 ELISA的种类和变化的种类和变化 ELISA的特点的特点 ELISA的应用实例的应用实例ELISA4.2.1 基本原理基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）

2、酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上结合后，再加上酶的相应底物，酶的相应底物，即起催化水解或即起催化水解或氧化还原反应而氧化还原反应而呈颜色。呈颜色。颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正颜色反应的深浅与相

3、应的抗体或抗原量成正比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。体或抗原。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。其方法简单，方便迅速，特异性强。4.2.2 酶及其底物酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作半抗原在交联剂作用下联结的产物。是用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促不仅

4、具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物同的底物，将得到不同的颜色反应。，将得到不同的颜色反应。4.2.3 ELISA的种类和变化的种类和变化（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（二）间接法（二）间接法（三）竞争法（三）竞争法 （四）双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕获法测（五）捕获法测IgMIgM抗体抗体（六）应用亲和素和生物素的（六）应用亲和素和生物素的ELISAELISA （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原间接法是检测抗体

5、间接法是检测抗体最常用的方法，其最常用的方法，其原理为利用酶标记原理为利用酶标记的抗抗体以检测已的抗抗体以检测已与固相结合的受检与固相结合的受检抗体，故称为间接抗体，故称为间接法。法。（三）竞争法（三）竞争法 此法可用于检测小分子抗原。此法可用于检测小分子抗原。对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，

6、使固相上结合的制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。较弱。4.2.4 特点特点特点一：灵敏性特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自酶。众所周知该测定法的灵敏度来自酶。众所周知,酶是一种有酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳上示踪抗原或抗

7、体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。克水平上对其进行定量。例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感水平，酶反应测定法的敏感度约为度约为510g/ml。特点二：特异性特点二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗

8、原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原（例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAgHBsAg）、）、e e抗原（抗原（HBeAgHBeAg）和核心抗体（）和核心抗体（HBcAgHBcAg），虽来源），虽来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。需先分离待检物。EL

9、ISAELISA应用实例应用实例 饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，简曲霉毒素简曲霉毒素 ）饲料中有害微生物的快速筛检饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌（如沙门氏菌 ）甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析 ELISA在饲料安全检测中的应用在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草剂与杀虫剂两大类主要有除草剂

10、与杀虫剂两大类 例如杀暝松（例如杀暝松（FN FN）、）、甲氟磷酸异已酶（甲氟磷酸异已酶（SOMAN SOMAN）、）、草不绿（草不绿（Alachor Alachor）、）、西维因（西维因（Carbaryl Carbaryl）、）、多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（Captan Captan）等。）等。农药的检测农药的检测：ELISA ELISA检测检测 “非典型肺炎非典型肺炎”冠状病毒冠状病毒 ELISA ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白检测抗异质性胞核核糖蛋白A2A2（hnRNPA2hnRNPA2）/类风湿性关节炎（类风湿性关节炎（PtAPtA）3333抗体抗体ELISAELISA在疾病诊断中的作用在疾病诊断中的作用 ELISA ELISA法检测幽门螺杆菌抗体法检测幽门螺杆菌抗体ELISAELISA试剂盒商业资讯试剂盒商业资讯ELISA试剂盒试剂盒酶联免疫井酶联免疫井DNM-9602GDNM-9602G酶标分析仪酶标分析仪DNM-9602 DNM-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪 DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪几种酶标分析仪几种酶标分析仪