肺炎链球菌检测讲解课件.ppt

1、肺炎链球菌检测肺炎链球菌检测培养、鉴定、分型简介简介l肺炎链球菌肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）简称简称肺炎球菌肺炎球菌（pneumococcus）。1881年首次由巴斯年首次由巴斯德（德（Louis Pasteur）及）及G.M.Sternberg分别分别在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰染在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。荚膜。5%10%正常人上呼吸道中携带此菌。正常人上呼吸道中携

2、带此菌。有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。标本中标本中SP形态形态形态：矛头状 排列：成双排列 特殊结构：可有荚膜 分布分布l在自然界中分布广泛，常生活在正常人的鼻咽部，多数不致病或致病力很弱，少数致病力较强。l在免疫力下降时致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿，年老体弱者易导致肺部感染。l无论从哪种标本中分离出肺炎链球菌，均应及时报告。国外感染情况国外感染情况l在美国，每年侵袭性SP感染的发生率为72-103/10万儿童，而欧洲为10-24/10万儿童/年。每年约有600多万例中耳炎由SP引起，占急性中耳炎30-50；在发展中国家，每年约有500万5岁以下儿

3、童死于SP引起的肺炎，10-50万儿童死于SP引起的脑膜炎。（2005年）国内情况国内情况l国内最早儿童肺炎链球菌脑膜炎个案报告在1942年。60年代中期以前研究资料显示SP肺炎、脑膜炎在冬春季发病较多，儿科住院病人中常见病例多发生在婴幼儿。SP性脑膜炎占化脑的11.1-22.1，仅次于流脑。SP也是小儿肺炎的重要病原菌之一，SP所致大叶性肺炎，5岁以下儿童中可占70国内情况国内情况l80年代后的研究资料显示SP脑膜炎占同期化脑的79.8。SP引起的败血症还是少见，约占5左右。一项13岁以下儿童中耳炎病原学研究显示SP引起的感染占病例31.7，是最常见的病原菌。广东地区情况广东地区情况l我院2

4、006年参与惠氏中国住院儿童肺炎流行病学调查研究，从入选的1097例肺炎住院儿童的痰标本中检出肺炎链球菌79例，检出率为7.2%。（中国抗感染化疗杂志）l我院2005年-2007年检出313株SP，10株来自血液培养（10/513），脑脊液25株（25/113），中耳炎患儿的炎症分泌物检出26株SP（26/133），来自呼吸道感染患儿的痰或咽拭子标本的SP有252株（252/1412）。（广东医学）广东地区情况广东地区情况l我院2005-2009年从化脓性脑膜炎患者脑脊液中共检出81株SP（24.18%，81/335）。（临床儿科杂志）l我院2011-2012年从中耳炎患者耳分泌物中检出270

5、株SP（36.78%，270/734）。l我院2012年从五官科腺样体手术病人的腺样体或扁桃体组织中检出SP104株（40.78%，104/255）。致病性致病性l在化脓性球菌中，肺炎链球菌的致病力仅次于金黄色葡萄球菌。l肺炎球菌主要的致病物质 有荚膜，肺炎链球菌溶素O，脂磷壁酸和神经氨酸酶等。荚膜具有抗原性，是肺炎荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。链球菌分型的依据。l所致疾病 主要引起大叶性肺炎，成人中75%由1,2,3,4,5,7,8,9,12型引起，半数以上为1,2,3型。3型产生大量荚膜物质，毒力强，病死率高。儿童以第6,14,19及23型肺炎链球菌感染最常见.可继发胸膜炎，脓胸

6、，中耳炎，脑膜炎和败血症等。肺炎链球菌感染的临床症状肺炎链球菌感染的临床症状l在儿童起病多急骤（少数患儿先有轻微的上呼吸道感染症状），中毒症状重。突然高热、体温可达4041，头痛、胸痛、呼吸急促，烦躁不安，早期往往不咳嗽或轻咳，病儿常不吐痰。年长儿可有寒战、咯吐铁锈色痰，但有的患儿仍咳黄脓痰。重症患儿可有惊厥、谵妄及昏迷等中毒性脑病的表现。实验室常规检测实验室常规检测l标本来源标本来源 痰、咽拭子、中耳分泌物、血液、脑脊液等。l分离培养分离培养 血琼脂培养基。初次分离最好提供5%-10%CO2。l常规鉴定常规鉴定 Option敏感试验、菊糖发酵试验、胆汁溶菌试验等。SP培养呼吸道标本的采集培养

7、呼吸道标本的采集l1.抗菌药物使用前取材；l2.最好清晨采取痰标本；l3.疑似细菌性肺炎患者痰标本每天一次，连续2-3天，不建议24h内多次送检，除非痰液外观性状发生明显改变；l4.自然咳痰法取样可用于成人，先应刷牙、清水漱口，量不少于1mL；SP培养呼吸道标本的采集培养呼吸道标本的采集l5.儿童以支气管镜抽吸为佳，肺泡灌洗液也不错，或者用弯压舌板压舌，棉拭子伸入咽部取样（临床医生操作）；l6.其他的经人工气道吸引分泌物、穿刺取样、胃内取样均可以取得合格标本（临床医生操作）。SP培养呼吸道标本的运输和保存培养呼吸道标本的运输和保存l尽快送检，要求2h内送到；l肺炎链球菌延迟送检极有可能死亡，而

8、且不适合4保存；l标本处理前检测是否合格。痰标本合格的标准：痰标本鳞状上皮细胞 白血球 细菌种类 合格 =10 1-3种 不合格 =25/低倍 3种培养特性培养特性l初次分离需要CO2，采用CO2培养箱较好；l18-24h形成细小、圆形、湿润、自溶的菌落，有草绿色溶血环。有少数菌株呈黏液型或颗粒状。l最好选用新鲜绵羊血的BAP，有效期应该注意，不像标示的有效期那么长。l加庆大霉素的血琼脂平板：在普通血琼脂中加入抑制剂庆大霉素注射液，混匀倾倒平板，琼脂中庆大霉素最后浓度相当于1.25 mg/250mL。粘液性菌落粘液性菌落SP常见菌落常见菌落鉴定鉴定lOptochin（乙基羟化奎宁，奥普托新）敏

9、感（生长抑制）试验：在涂布细菌的血琼脂平板上贴5g的Optochin纸片，35有氧环境下过夜，出现14mm的抑菌环为敏感，草绿色链球菌仅小抑菌环或无抑菌环，肺炎链球菌有少数菌株不敏感。对疑似OP不敏感的肺炎链球菌可用胆汁溶菌试验鉴定。OP敏感敏感鉴定鉴定l胆盐溶菌试验：滴加胆汁酸盐在血平板上生长的菌落上，置3710-30min，可以看到滴加试剂的部位菌落溶化。试管法：在0.9mL隔夜培养液中加入0.1mL去氧胆酸钠溶液，37水浴1030分钟，培养液由浊变清为阳性。用生理盐水代替去氧胆酸钠溶液作阴性对照。l能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、菊糖等多种糖类，不分解甘露醇、山梨醇。鉴定鉴定l有明显的菌落特

10、征：中心凹陷（自溶）。不典型菌落与其他非溶血链球菌鉴别肺炎链球菌：OPOP敏感、胆汁溶菌阳性、胆汁七叶苷阴性敏感、胆汁溶菌阳性、胆汁七叶苷阴性；草绿色链球菌：三个试验均阴性三个试验均阴性；牛链球菌：OPOP和胆汁溶菌阴性，胆汁七叶苷阳性。和胆汁溶菌阴性，胆汁七叶苷阳性。SP菌种保存菌种保存l保存液配制 TSB 3g，甘油25mL，蒸馏水100mL，灭菌后加入无菌马血清100mL，分装在无菌干燥管。l保存 挑选新鲜培养物置于保存管中，-76保存。l复活 取出保存管自然平衡至室温，接种适合平板。SP血清学分型：血清学分型：l肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗研究提供可靠依据，也是一种流行病学

11、调查手段。l肺炎链球菌的抗原成分较多，有菌体核蛋白、菌体种属特异性抗原、荚膜多糖抗原等。SP血清学分型血清学分型l荚膜多糖抗原荚膜多糖抗原：亦称型特异性抗原，存在于肺炎链球菌的荚膜中，由大量多聚体组成，能溶于水，有型特异性，故称之为可溶性特异性物质（SSS）。不同菌株所含荚膜多糖不同，故可用凝集、沉淀和荚膜肿胀试验，进行肺炎链球菌分型。目前至少可将有荚膜的肺炎链球菌分成83个血清型。血清分型血清分型l丹麦Statens Serum Copenhagen公司产pneumotest-kit 23价标准血清分型试剂盒；l原理：荚膜肿胀试验；l观察：相差显微镜观察最好，可以看到菌体周围有一无色宽厚的环

12、状荚膜。血清分型血清分型l我们的做法：以亚甲蓝染色亚甲蓝染色，普通显微镜可以观察，菌体蓝色，周围有一圈着色较浅的宽的荚膜。血清分型：血清分型：l1 细菌复苏：将肺炎链球菌冻存管从-76冰箱取出，挑取3-5L菌液接种于普通羊血培养基，35、5%CO2培养18-24小时，挑取单个菌落做次代培养。l2 配制PBS溶液，并分装小试管，每管约0.5mL，用亚甲蓝粉配制0.1的亚甲蓝试剂。SP血清学分型步骤：血清学分型步骤：l3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌落，放入小试管中，制成菌悬液约0.5麦氏单位浓度。l4 用接种环挑取约10L菌悬液放入载玻片上，再挑取同量的诊断血清（10l）放入载玻片上，

13、并与菌悬液搅拌混匀。SP血清学分型步骤：血清学分型步骤：l5 再加入一接种环0.1的亚甲蓝溶液放入载玻片上与抗血清混匀一分钟，盖上盖玻片，在显微镜下观察是否有荚膜或凝集出现。l6 出现凝集或荚膜肿胀的抗血清型即为该肺炎链球菌的血清型。常见的血清型：常见的血清型：l常引起人类疾病的血清型20多种，最常见的血清型有：6B、9V、14、19A、19F、23F。国内儿童流行的主要是：6A、6B、23F、19F、14、4、不定型。国内儿童的血清型流行情况：国内儿童的血清型流行情况：地区标本 对象常见血清型北京痰或深部呼吸道标本5岁以下肺炎住院儿童6A、23F、6B、19F、14、不定型上海痰或深部呼吸道

14、标本5岁以下肺炎住院儿童6A、6B、19F、23F、不定型广州痰或深部呼吸道标本5岁以下肺炎住院儿童6A、23F、19F、15B、4、6B、不定型深圳痰或深部呼吸道标本5岁以下肺炎住院儿童23F、19F、15B、4、19A、不定型7价疫苗和价疫苗和13价疫苗比较价疫苗比较l7价疫苗：4,6B,9V,14,18C,19F,23F。l13价疫苗：以上7价加上1,3,5,6A,7F,19A。疫苗涵盖（疫苗涵盖（100）地区7价疫苗13价疫苗北京3570上海7889广州7797深圳8793肺炎链球菌血清型流行趋势肺炎链球菌血清型流行趋势l肺炎链球菌的血清型分布随国家和年龄组的变化不大，欧洲国家和美国有

15、着相似的血清型分布，美国的常见血清型依次为6B、19F、23F、14、18C，荷兰常见的血清型分布依次为19F、6B、6A、9V、23F。l亚洲的情况略有不同，韩国以15、14、6B、19F较普遍，而印度以6、14、19、15型较多见。（2006年）SP的药物敏感性的药物敏感性l除万古霉素外，对其他药物均有耐药性菌株出现；l对青霉素的耐药不是-内酰胺酶引起，不能用-内酰胺酶试验来预测青霉素的敏感性；l青霉素的敏感性可以用1g的苯唑西林（OX）纸片检测，抑菌环20mm，表示对青霉素敏感，对头孢曲松和头孢噻肟也敏感；肺炎链球菌的药物敏感性肺炎链球菌的药物敏感性lOX抑菌环20mm时应该检测青霉素的

16、MIC；l筛选青霉素的耐药性只用1gOX，不能以甲氧西林或青霉素纸片代替，防止假敏感性出现；l药敏试验的培养基：加5%脱纤维羊血的MH平板。敏感性预测敏感性预测l青霉素MIC 能预报对其他-内酰胺类敏感性：l青霉素MIC0.06g/ml（或苯唑西林的抑菌环20mm）提示分离株对氨苄西林（口服或注射）、氨苄西林/舒巴坦、头孢克罗、头孢地尼、头孢托仑、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢唑肟、头孢呋辛、亚胺培南、氯碳头孢和美洛培南等敏感。l青霉素MIC2g/ml 提示对阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和厄他培南等敏感。本地耐药情况趋势：本地耐药情况趋势：广东地区儿童PRSP低于匈牙利

17、、韩国、台湾，与香港接近，高于上海、北京，表明广州地区儿童鼻咽部肺炎链球菌对青霉素的耐药情况较为严重，且有上升趋势，可能与滥用抗生素，使细菌产生诱导性耐药有关，也可能由于青霉素不敏感克隆株在国内的传播和蔓延。本地区耐药情况本地区耐药情况大环内脂类抗生素的耐药情况较为严重，其中红霉素的耐药率达80.5%，且多数为高度耐药，其中59%的菌株MIC为256g/ml，其耐药情况与杭州地区的红霉素的耐药率90.1%、74%的菌株MIC为256g/ml比要低，大环内酯类抗生素的广泛使用可能是造成其耐药率增加的重要原因；本地区耐药情况本地区耐药情况 对红霉素、四环素、复方新诺明、克林霉素和氯霉素的多重耐药情况较为严重，多重耐药发生率为75%，高于北京、上海、杭州地区。实验室安全防护实验室安全防护l根据病原微生物生物实验室生物安全管理条例中的有关规定，肺炎链球菌属于三类，要求在BSL-2实验室操作；l最好在二级生物安全柜中操作；l当必须在生物安全柜外处理标本时，需采取面部保护措施（眼镜或护目镜、口罩、面罩、或其他防溅装置），以免传染源或其他有害物溅洒到面上。