骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中作用的研究课件.ppt
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- 关 键 词:
- 蛋白 炎症 性肠病 发病 机制 作用 研究 课件
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1、骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中作用的研究作者:#目 录Contents一前言二材料和方法四结论三结果一 前言目 录Contents二 材料与方法三 结果四 结论又称为Spp1(分泌型磷酸糖蛋白1)或ETA-1(早期T淋巴细胞活化因子),是一种多功能的胞外基质蛋白,表达于多种组织和细胞中;有两种形式:分泌型骨桥蛋白(sOPN)和胞内型骨桥蛋白(iOPN);早期研究发现,OPN能够抑制炎症反应的发生,但在不同的环境中OPN的作用可能会表现出不同的侧重。骨桥蛋白(OPN)研究背景累及全消化道的一种特发性肠道炎症性疾病;病因和发病机制尚未完全明确,已知肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发
2、病中起重要作用;研究发现,OPN在炎症性肠病患者发炎的肠道组织中的表达增加。炎症性肠病(IBD)对患者会产生何种影响?问题目 录Contents一 前言二 材料与方法三 结果四 结论研究目的(1)采用IBD小鼠模型实验观察OPN缺失对小鼠自发性结肠炎的影响(2)研究骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中的作用目 录Contents二 材料与方法一 前言三 结果四 结论研究对象1野生型(WT)小鼠48只2白介素-10基因敲除(IL-10KO)小鼠74只3骨桥蛋白基因敲除(OPNKO)小鼠24只4骨桥蛋白/白介素-10双敲除(OPN/IL-10DKO)小鼠74只注选用3-12周的雌鼠。所有的小鼠在实验监控
3、期间都经确诊不携带仙台病毒,肝炎病毒,先天性脚趾不全畸形病毒,淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒,霉浆菌,毛发样梭状芽孢杆茵,库氏棒杆菌和沙门氏菌。临床症状临床评分标准目 录Contents体重下降超过5%脱肛腹泻二 材料与方法一 前言三 结果四 结论对IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠的临床症状表现进行评分。出现该临床症状计1分,否则为0。合计得出总分。肛周粘液分泌物目 录Contents二 材料与方法一 前言三 结果四 结论实验方法与步骤患结肠炎小鼠患结肠炎小鼠结肠结肠组织组织切片微观分析切片微观分析基因表达定量分析基因表达定量分析荧光原位杂交技术(荧光原位杂交技术(FISHFISH)检
4、测分泌的磷蛋白检测分泌的磷蛋白1 1基因编码基因编码区区OPNOPN酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法量化上清液中量化上清液中TNF-TNF-、IL-6IL-6、IL-12p40IL-12p40含量含量小鼠肠粘膜固有层单个小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离核细胞的分离末端限制性片段长度多态性末端限制性片段长度多态性分析分析提取小鼠腹腔巨噬细提取小鼠腹腔巨噬细胞胞分析分析吞噬作用吞噬作用肠系膜淋巴结细菌种类的肠系膜淋巴结细菌种类的鉴别鉴别统计分析统计分析(非参数非参数Mann-Whitney U Mann-Whitney U 检验或检验或BonferroniBonferroni校正单向分析校正单向分析)
5、87654321910小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的准备和刺激准备和刺激目 录Contents二 材料与方法一 前言三 结果四 结论实验方法与步骤1.提取mRNA(异硫氰酸胍-酚氯仿法);2.进行反转录(SuperScriptII反转录酶);3.分析互补DNA对GAPDH,IL-6,IFN-,IL-17A和CD11bmRNA的表达(LightCycler480SystemII);4.目的基因以GAPDH为参照标准。基因表达定量分析GAPDH5-CAACTTTGTCAAGCTCATTTCC-3(正)5-GGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3(反)IL-65-AGTCCGG
6、AGAGGAGACTTCA-3(正)5-ATTTCCACGATTTCCCAGAG-3(反)IFN-5-AGCTCTTCCTCATGGCTGTT-3(正)5-ATCTGGCTCTGCAGGATTTT-3(反)IL-17A5-TCTCTGATGCTGTTGCTGCT-3(正)5-CGTGGAACGGTTGAGGTAGT-3(反)CD11b5-GCTCCGGTAGCATCAACAAC-3(正)5-AGTGAATCCGGAACTCGTCCG-3(反)引物序列目 录Contents二 材料与方法一 前言三 结果四 结论实验方法与步骤1.小鼠股骨和胫骨骨髓中提取骨髓细胞;2.含10%热灭活的胎牛血清,10
7、0mg/ml链霉素,100mg/ml青霉素和40ng/ml重组巨噬细胞集落刺激因子RPMI1640培养液中37C培养5天;3.衍生的巨噬细胞按5105个细胞/孔接种于6孔培养板,经10ng/mlIFN-隔夜孵化后,用以下刺激物(Pam3CSK450-500ng/ml、LPS100ng/ml、ODN1585500nM)刺激细胞24h;4.吸取上清液-80冷冻保存备用。小鼠骨髓巨噬细胞的准备和刺激目 录Contents二 材料与方法一 前言三 结果四 结论实验方法与步骤1.小鼠结肠组织切片,PBS冲洗;2.含5mMEDTA和1mM二硫苏糖醇汉克平衡盐缓冲液中去除上皮细胞;3.含0.5mg/ml胶原
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