鼠疫检测新技术新方法课件(同名173).ppt
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1、鼠疫检测新技术新方法一、核酸检测技术一、核酸检测技术定义:对动植物、微生物的基因序列进行测定。定义:对动植物、微生物的基因序列进行测定。核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化内容:内容:聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR(PCR技术技术)核酸杂交技术核酸杂交技术核酸的纯化与分离核酸的纯化与分离目的:获得完整的核酸一级结构,并提高核酸纯度。破碎细胞(细菌)技术流程 核酸提取 核酸纯化材料的前处理材料的前处理细胞破碎,核酸释放细胞破碎,核酸释放核酸分离、纯化核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸,去除杂质沉淀或吸附核酸,去除杂质核酸溶解缓冲液核酸溶解缓冲液全自动核酸、蛋白提取仪全自动核酸、蛋白提取仪聚合酶链式反
2、应(PCR技术)简史 1971年,Khorana提出DNA变性后,与合适引物进行杂交,在DNA聚合酶作用下,延伸引物,并不断重复该过程,即可克隆tRNA基因。1985年,Mullis等人 发明聚合酶链反应(PCR),随后,Mullis所属公司PE推 出第一台PCR自动化热循环仪。基本原理:基本原理:基本步骤基本步骤随后,Mullis所属公司PE推标记技术:用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体(或抗原)进行抗原-抗体反应。M 1 2 3 4 5 6HRP-F1McAb冻干剂,F1McAb包被板,鼠疫F1阳性对照、阴性对照,PBS(稀释液),显色液(邻苯二胺),终止液(2M硫酸)。洗涤一
3、般采用以下方法:1、吸干孔内反应液。巢式PCR 3.预变性95 5min 1个循环随后,Mullis所属公司PE推反向PCR 5.待检测模板(基因组DNA)待检测模板(基因组DNA)发明聚合酶链反应(PCR),反向PCR 5.定量PCR 4.随后,Mullis所属公司PE推3、放置3分钟,略作摇动。(-)无色或颜色很浅待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上,与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。实时定量实时定量PCRPCR仪仪PCRPCR仪仪凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶电泳系统凝胶电泳系统PCRPCR结果判定(凝胶电泳)结果判定(凝胶电泳)PCRPCR类型类型
4、 1.1.多重多重PCRPCR 2.2.巢式巢式PCRPCR 3.3.定量定量PCRPCR 4.4.反向反向PCRPCR 5.5.逆转录逆转录PCRPCRPCRPCR技术在鼠疫检测中的应用技术在鼠疫检测中的应用鼠疫菌鼠疫菌PCRPCR检测法:检测法:从疑似鼠疫的标本(全血、组织)中检测鼠疫菌,以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。鼠疫判定标准:鼠疫判定标准:PCR PCR扩增(扩增(fra fra+plapla)+胶体金抗原检测胶体金抗原检测 or or 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 oror反相血凝试验反相血凝试验=确诊鼠疫确诊鼠疫鼠疫菌核酸检测样本处理鼠疫菌核酸检测样本
5、处理样本类别样本类别1.1.鼠疫菌培养物鼠疫菌培养物2.2.鼠疫病人血液、痰液或尸检鼠疫病人血液、痰液或尸检标本标本3.3.自毙或捕获动物血液或组织自毙或捕获动物血液或组织脏器(肝脏、脾脏等)脏器(肝脏、脾脏等)4.4.媒介昆虫媒介昆虫4、吸干孔内液,也可倾去液体后在吸水纸上拍干,洗涤次数3-4次,又是需洗5-6次。洗涤一般采用以下方法:1、吸干孔内反应液。洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。(-)无色或颜色很浅显色的最后一部是温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物,反应温度和时间仍是影响显色的因素,在定量测定中加入底物
6、后的温度和时间应按规定力求准确,而在定性测定中,可根据显色程度适当提高温度,或者适当缩短或延长反应时间。全自动核酸、蛋白提取仪采用F1抗体包被反应板,加入待测标本,反应除去未结合物质,加入HRP-F1MCAb,如待测标本中含有F1抗原时就与包被F1抗体、HRP-F1抗体结合形成复合物,加入OPD底物产生显色反应,反之就无显色反应。M 1 2 3 4 5 6标记技术:用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体(或抗原)进行抗原-抗体反应。目测:平持反应版,距白色背景5-10cm,从板的正上方观察。洗涤一般采用以下方法:1、吸干孔内反应液。出第一台PCR自动化热循环仪。Fra-R(5-ACCT
7、GCTGCAAGTTTACCGCC-3)发明聚合酶链反应(PCR),2、将洗涤液注满孔板。变性72 5min使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.出第一台PCR自动化热循环仪。M 1 2 3 4 5 6待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上,与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。样品处理方法样品处理方法1.1.煮沸法煮沸法2.DNA2.DNA提取试剂盒提取试剂盒3.CTAB3.CTAB法法4.4.氯仿抽提法氯仿抽提法鼠疫菌鼠疫菌PCRPCR检测检测反应体系反应体系10 x bufferdNTPsFra-F(5-GGAACCACTAGCACAT
8、CTGTT-3)Fra-R(5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3)Pla-F(5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3)Pla-R(5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3)Taq聚合酶待检测模板(基因组DNA)去离子水鼠疫菌鼠疫菌PCRPCR检测检测反应程序反应程序预变性95 5min 1个循环变性95 1min退火72 1min延伸72 1min变性72 5min30个循环 M 1 2 3 4 5 6内参基因内参基因 Pla Fra鼠疫鼠疫PCRPCR检测电泳结果判定检测电泳结果判定阳性结果:内参基因阳性结果:内参基因+Pla+Fra+Pla+
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