食品中微生物毒素的测定技术课件.ppt

1、食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术第一节第一节 食品中黄曲霉毒素的测定方法食品中黄曲霉毒素的测定方法第二节第二节 食品中杂色曲霉毒素的测定方法食品中杂色曲霉毒素的测定方法第三节第三节 食品中赭黄曲霉毒素的测定方法食品中赭黄曲霉毒素的测定方法第四节第四节 食品中葡萄球菌肠毒素的测定方法食品中葡萄球菌肠毒素的测定方法食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术第一节第一节 食品中黄曲霉毒素的测定方法食品中黄曲霉毒素的测定方法 一、概述一、概述 黄曲霉毒素（Aflatoxin,简称AFT）是由黄曲霉和寄生曲霉等产毒菌株的代谢产物。1 1化学结构化学结构 它是一组化学结构类似

2、的化合物，其基本结构均含有一个双氢呋喃环和一个氧杂萘邻酮。目前已知的黄曲霉毒素约有26种，除了有黄曲霉毒素 Bl、B2、Gl、G2、ML、M2、B2a、G2a、BM2a、GM2a外，尚有多种黄曲霉毒素的代谢产物、异构体和相似物，如L、L-H1、2，3-二羟基Bl、Bl-2，3环氧化物、四氢脱氧-Bl、1-甲氧基B2、2-甲氧基B2、1-乙氧基G2、1-乙氧基B2、1-乙酰氧基B2、GM1、Q1、Q2a、Q1-HS、B3、P1等。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 黄曲霉毒素是一类在紫外线照射下能发出强烈特殊荧光的物质，根据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B

3、、G两大族，其中B族毒素发出蓝色荧光，而G族毒素发出绿色荧光。B族中有AFTBl、B2、ML、M2、B2a、BM2a、L、L-H1、2，3-二羟基Bl、Bl-2，3环氧化物、四氢脱氧-Bl、1-甲氧基B2、2-甲氧基B2、1-乙氧基B2、1-乙酰氧基B2、Q1、Q2a、Q1-HS、B3、P1；G族中有AFTGl、G2、G2a、GM2a、1-乙氧基G2、GM1等。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 2 2理化性质理化性质 黄曲霉毒素的相对分子质量为312346，熔点为200300。难溶于水，不溶于己烷、乙醚和石油醚，易溶于油、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二甲基甲酰等有机溶剂。一般在

4、中性及酸性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH910的强酸溶液中分解迅速，生成几乎无毒的盐，但反应是可逆的。其纯品为无色结晶，耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度高达280，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 3 3主要产毒菌株主要产毒菌株 黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉（产量较少），它们污染食物后生长繁殖产生的毒素。4.4.分布分布 黄曲霉、寄生曲霉等霉菌在自然界普遍存在，很容易污染食品，尤其是花生、玉米和核桃。在大豆、稻谷、小麦、通心粉、皮蛋、调味品、牛奶、奶制品、食用油、干咸鱼及辣椒等食品中也经常发现黄曲霉毒素。其污染程度受地区

5、和季节因素以及作物生长、收获、贮存的不同条件影响。表5-1中列出了世界各地各种食品中黄曲霉毒素存在的情况。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 黄曲霉毒素产毒菌株的生长繁殖最适宜的条件是：温度3038、相对湿度80%以上。实验证明，当温度为2832、相对湿度在80%以上时产生AFT量最高。一般在热带和亚热带地区AFT的检出率比较高。在中国，华中、华南地区产毒菌株相对较多，产毒量也大，东北、西北地区相对较少。5.5.毒性毒性 黄曲霉毒素能引起人及动物肝脏组织受破坏，严重时，可导致肝癌甚至死亡。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（

6、WHO）的癌症研究机构划定为I类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 在各种黄曲霉毒素中，以AFTB1的毒性和致癌性最强。比其他化学致癌剂氰化钾还高，比二甲基偶氮苯大900倍，比二甲基硝胺大75倍，相对而言,AFTG1和M1的致癌性较弱。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强，故食品中污染的黄曲霉毒素含量常以AFTB1为主要指标。6.6.限量限量 1995年，世界卫生组织制定的食品中黄曲霉毒素最高允许浓度为15g/kg。中国政府对食品中黄曲霉毒素的含量有严格规定，国家标准GB2761规定了黄曲霉毒素在食品中的允许最大浓

7、度，见表5-2。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒素含量（指B1+B2+G1+G2的总量）不能超过15g/kg，人类消费的牛奶中的含量不能超过05g/kg，其他动物饲料中的含量不能超过300g/kg。而欧盟国家规定更加严格，要求人类生活消费品中的黄曲霉毒素B1的含量不能超过2g/kg，总量不能超过4g/kg，牛奶和奶制品中的黄曲霉毒素M1含量不能超过005g/kg，世界各国及地区对花生及其制品中黄曲霉毒素的最高允许含量见表5-3。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生

8、物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 本节主要介绍食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2总量、黄曲霉毒素M1与B1的测定方法。二、食品中黄曲霉毒素二、食品中黄曲霉毒素B B1 1的测定的测定 （一）薄层色谱法（一）薄层色谱法 （TLCTLC）薄层色谱法是中华人民共和国国家标准GB/T5009.222003黄曲霉毒素B1的测定方法中的第一法，此法适用于粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中AFTB1的测定方法，在此法中，薄层板上AFTB1的最低检出量是0.0004g，检出限为5g/kg。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素

9、的测定技术 1 1原理原理 试样中黄曲霉毒素B1经有机溶剂提取、净化、浓缩，并经薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量来测定AFTB1的含量。2 2试剂试剂 （1）试剂 三氯甲烷、正己烷或石油醚（沸程3060或6090）、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚（经无水硫酸钠脱水）、丙酮、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、硅胶G（薄层色谱用）。苯-乙腈（98+2）混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混匀。甲醇-水（55+45）溶液：量取55mL甲醇，加45mL蒸馏水，混匀。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 （2）AFTB1标准溶液 AF

10、TB1标准贮备液 用百万分之一的微量分析天平精密称取11.2mgAFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100 mL，避光置于4冰箱中保存。先用紫外分光光度计测定配制的AFTB1标准贮备液浓度，再用苯-乙腈混合液调整其浓度为10g/mL。在350nm，AFTB1在苯-乙腈（98:2）混合液中的摩尔消光系数为19 800。AFTB1标准使用液（1g/mL）精密吸取1.0 mL 10g/mLAFTB1标准溶液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混匀。此液含AFTB1为1g/mL。AFTB1标准使用液（0.2g/mL）精密吸取1.0 mL 1g/mLAFTB1标准应用液于5mL

11、容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，摇匀。此液含AFTB1为0.2g/mL。AFTB1标准使用液（0.04g/mL）精密吸取1.0 mL 0.2g/mLAFTB1标准应用液于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，摇匀。此液含AFTB1为0.04g/mL。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 （3）消毒液 50g/L次氯酸钠溶液 称取100g漂白粉精，加入500mL水，搅拌均匀。另将160g工业用碳酸钠（Na2CO310H2O）溶于500mL温水中。再将两液混合、搅匀，澄清后过滤，贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，作为AFTB1消毒剂。3 3主要仪器主要仪器 小型粉碎机、分样筛、电动振荡

12、器、全玻璃浓缩器或250mL索氏抽提器、玻璃板（5cm20cm）、薄层板涂布器、展开槽（内长25cm、宽6cm、高4cm）、紫外光灯（lOO125W，带有波长365nm滤光片）、微量注射器或血色素吸管等。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 4 4操作步骤操作步骤 （1）取样 试样中污染黄曲霉毒素高的霉粒一粒可以左右测定结果，而且有毒霉粒的比例小，同时分布不均匀。为避免取样带来的误差，应大量取样，并将该大量试样粉碎，混合均匀，才有可能得到确能代表一批试样的相对可靠的结果，因此采样应注意以下几点：根据规定采取有代表性试样。对局部发霉变质的试样检验时，应单独取样。每份分析测定用的试

13、样应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至0.51kg，然后全部粉碎。粮食试样全部通过20目筛，混匀。花生试样全部通过10目筛，混匀。或将好、坏分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等试样不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批试样可采取3份大样作试样制备及分析测定用，以观察所采试样是否具有一定的代表性。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 （2）样品预处理（提取、净化与浓缩）玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等 甲法：称取20.OOg粉碎过筛试样（面粉、花生酱不需粉碎），置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和lOOmL甲醇-水溶液，在瓶塞上涂上一

14、层水，盖严防漏。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇-水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.OOmL甲醇-水溶液（相当于4g试样）置于另一个125mL分液漏斗中。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 在第二个分液漏斗中加20mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层，（如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层）。放出三氯甲烷层，经盛有约10g先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，分液漏斗中再加5mL三氯甲烷于重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿

15、放在通风柜于65水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却23min后，准确加入1mL苯-乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入lmL苯-乙腈混合液）。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 乙法：（限于玉米、大米、小麦及其制品）。称取20.OOg粉碎过筛试样于250mL具塞锥形瓶中，用滴管滴加约6mL水，使试样湿润，准确加入60mL三氯甲烷，振荡30min，加12g无水硫酸钠，振摇后，静置30min，用叠成折叠式的快

16、速定性滤纸过滤于lOOmL具塞锥形瓶中。取12mL滤液（相当4g试样）于蒸发皿中，在65水浴上通风挥干，准确加入lmL苯-乙腈混合液，用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 花生油、香油、菜油等 称取4.00g混匀的试样置于小烧杯中，用20mL正己烷或石油醚将试样转移于125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分次洗烧杯，洗液一并移人分液漏斗中，振摇2min，静置分层后，将下层甲醇-水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5mL甲醇-水溶

17、液重复振摇提取一次，提取液一并移人第二个分液漏斗中。在第二个分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，（以下按“甲法”自“振摇2min，静置分层”起依法操作）。酱油、醋、发酵酒类 称取10.OOg试样于小烧杯中，为防止提取时乳化，加0.4g氯化钠（发酵酒类不加），移人分液漏斗中，用15mL三氯甲烷分次洗涤烧杯，洗液并人分液漏斗中。（以下按“甲法”自“振摇2min，静置分层”起依法操作）。最后加入2.5mL苯-乙腈混合液，此溶液每毫升相当于4g试样。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 或称取10.OOg试样，置于分液漏斗中，再加12mL甲醇（以酱油体积代替水，故甲醇与水的体积比仍约为55

18、+45），用20mL三氯甲烷提取，（以下按“甲法”自“振摇2min，静置分层”起依法操作）。最后加入2.5mL苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4g试样。干酱类（包括豆豉、腐乳制品）称取20.OOg研磨均匀的试样，置于250mL具塞锥形瓶中，加入20mL正己烷或石油醚与50mL甲醇-水溶液。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式快速定性滤纸过滤，滤液静置分层后，取24mL甲醇-水层（相当8g试样，其中包括8g干酱类本身约含有4mL水的体积在内）置于分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，（以下按“甲法”自“振摇2min，静置分层”起依法操作）。最后加人2mL苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4g试样

19、。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 （3）测定 A单向展开法 薄层板的制备 称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量23倍左右的水，用力研磨l2min,至成糊状后立即倒于涂布器内，推成5cm20cm，厚度约0.25mm的薄层板三块。在空气中干燥约15min后，在100下活化2h，取出放干燥器中保存。一般可保存23天，若放置时间较长，可再活化后使用。点样 将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为lcm，点直径约3mm。在同一块板上滴加样点的大小应一致，滴加时可用吹风机的冷风边点边吹。滴加的4个

20、样点如下：第一点：lOL 0.04g/mL AFTB1标准使用液。第二点：20L样液。第三点：20L样液+lOL0.04g/mL AFTB1标准使用液。第四点：20L样液+lOL0.02g/mL AFTB1标准使用液。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 展开与观察 在展开槽内加l0mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加l0mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展开l012cm，取出。在紫外光下观察结果，方法如下:第一点滴加了l0L 0.04g/mL AFTB1标准使用液，其中含黄曲霉毒素B1是0.0004g，是AFTB1的最低检出量点。同时，此点还可以检验薄层板好

21、坏和色谱条件是否合适，若展开后此点无荧光，则可能是薄层板未制好，或色谱条件有问题。第三点和第四点的样液点滴加了AFTB1标准使用液，可使样点中AFTB1荧光点与AFTB1标准使用液荧光点重叠。如样液点为阴性，薄层板上的第三点中AFTB1为0.0004g，可用作检查在样液内AFTB1最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中AFTB1为0.002g，主要起定位作用。在上述色谱条件下，AFTB1的Rf0.6左右。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 第二点是样点。在与AFTB1标准点的相应位置（Rf0.6）上无蓝紫色荧光点，而其他点均有荧光点，表示试样中AF

22、TB1含量在5g/kg以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。确证试验 为了证实薄层板上样液荧光确系由AFTB1产生的，滴加三氟乙酸，使其与AFTB1反应，产生AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值Rf0.1左右。方法是于薄层板左边依次滴加两个点。第一点：lOL 0.04g/mL AFTB1标准使用液。第二点：20L样液。于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min后，使热风吹到薄层板上的温度不高于40，再于薄层板右边滴加以下两个点。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 第三点：lOL 0.04g/mL AFTB1标准使用液。第

23、四点：20L样液。再展开（同），在紫外光灯下观察样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物（Rf0.1）。未加三氟乙酸的第三点和第四点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。稀释定量 样液中（4g样品/mL，点样20L）的AFTB1荧光点的荧光强度如与AFTB1标准点的最低检出量（0.0004g）的荧光强度一致，则试样中AFTB1含量即为5g/kg。如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少点样量，或将样液稀释后再点样，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。点样形式如下：第一点：lOL 0.04g/mL AFTB1标准使用液。第二点：根据情况点lOL样液。第三点：根据情

24、况点l5L样液。第四点：根据情况点2OL样液。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 结果计算 试样中黄曲霉毒素B1的含量按下式进行计算：X=0.0004 （5-1）式中：X 试样中AFTB1的含量，g/kg；Vl 加入苯-乙腈混合液的体积，mL；V2 出现最低荧光强度时滴加样液样液的体积，mL；D 样液的总稀释倍数；m 加入苯-乙腈混合液溶解时相当试样的质量，g；0.0004 AFTB1的最低检出量，g；结果表示到测定值的整数位。mVDV1211000食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 B双向展开法 如用单向展开法展开后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素B

25、1的荧光强度，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚作横向展开，将于扰的杂质展至样液点的一边而黄曲霉毒素B1不动，然后再用丙酮-三氯甲烷（8+92）作纵向展开，试样在黄曲霉毒素B1相应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法灵敏度。如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂质干扰时，则可改用滴加一点法。滴加两点法 点样 取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加AFTB1标准使用液与样液。即在三块板的距左边缘0.8lcm处各滴加10L 0.04g/mL AFTB1标准使用液，在距左边缘2.83cm处各滴加20L样液，然后在第二块板的样液点上加滴10L 0.04g/mL AFTB1标准使用液，在第三块板的样液点上

26、加滴10L 0.2g/mL AFTB1标准使用液。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 展开 横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干，或根据情况需要时可再重复展开12次。纵向展开：挥干的薄层板，以丙酮-三氯甲烷（8+92）展开至1012cm为止。丙酮与三氯甲烷的比例根据不同条件自行调节。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 观察及评定结果 在紫外光灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在AFTB1标准点的相应处出现低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，则试样

27、中AFTB1含量在5g/kg以下。若第一板在与第二板的相同位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，第一、二、三板可以同时做，也可按照顺序做。如按顺序做，当在第一板出现阴性时，第三板可以省略；如第一板为阳性，则第二板可以省略，直接作第三板。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 确证试验 另取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘0.81cm处各滴加10L 0.04g/mL AFTB1标准使用液及1小滴三氟乙酸；在距左边缘2.83cm处，于第四板滴加20L样液及1

28、小滴三氟乙酸；于第五板滴加20L样液和10L 0.04g/mL AFTB1标准使用液及1小滴三氟乙酸，反应5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液AFTB1含量高时，则将样液稀释后，再做确证试验。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 稀释定量 如样液AFTB1含量高时，将样液稀释后再点样，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止;如AFTB1含量低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响结果的判断，可将样液再

29、做双向展开法测定，以确定含量。结果计算 同公式（5-1）。滴加一点法：点样 取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加AFTB1标准使用液与样液。即在三块板距左边缘0.8lcm处各滴加20L样液，在第二板的点上加滴10L 0.04g/mL AFTB1标准使用液，在第三板的点上加滴10L 0.2g/mL AFTB1标准使用液。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 展开（同滴加两点法）的横向展开与纵向展开。观察及评定结果 在紫外光灯下观察第一、二板，如第二板出现最低检出量的AFTB1标准点，而第一板与其相同位置上未出现荧光点，试样中AFTB1含量在5g/kg以下。如第一板在与第二板AF

30、TB1相同位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上与第一板相同位置的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，如果重叠再进行以下确证试验。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 确证试验 另取两板，于距左边缘0.81cm处，第四板滴加20L样液、1滴三氟乙酸；第五板滴加20L样液、10L 0.04g/mL AFTB1标准使用液及1滴三氟乙酸。（产生衍生物及展开方法同滴加二点法）。再将以上二板在紫外光灯下观察，以确定样液点是否产生与AFTB1标准点重叠的衍生物，观察时可将第一板作为样液的衍生物空白板。经过以上确证试验定为阳性后，再进行稀释定量，如含AFTB1低，不需稀释或稀释倍

31、数小，杂质荧光仍有严重干扰，可根据样液中AFTB1荧光的强弱，直接用双向展开法定量。结果计算 同公式（5-1）。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 （二）酶联免疫吸附法（二）酶联免疫吸附法（ELISAELISA）免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。在抗原与抗体反应形成复合物后，该酶结合物的酶作用于加入的底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定性或定量抗体/抗原。酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是免疫酶技术的一种。其特点是利用聚苯乙烯微量反应板（或球）吸附抗原/抗体，使之

32、固相化。免疫反应和酶促反应在其中进行。无论是免疫反应，还是酶促反应，每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了未反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA法中酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗（抗抗体）、三抗再次进行免疫反应。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 此法简便、敏感、特异，可作为多种抗原或抗体的定量测定，故而得到广泛应用。20世纪70年代后期，该法被引入到真菌毒素的检测中。酶联免疫吸附法是中华人民共和国国家标准GB/T5009.222003黄曲霉毒素B1的测定方法中的第二法，此法适用于粮食、花生及其制品、薯类、豆

33、类、发酵食品及酒类等各种食品中AFTB1的测定方法，在此法中，AFTB1的检出限为0.01g/kg。1 1原理原理 试样中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较测定含量。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 2 2仪器仪器 小型粉碎机、电动振荡器、酶标仪（内置490nm滤光片）、恒温水浴锅、恒温培养箱、酶标微孔板、微量加样器及配套吸头等。3 3试剂试剂 （1）试剂 三氯甲烷、甲醇、石油醚、牛血清白蛋白（BSA）、邻苯二胺（OPD）、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、

34、氯化钾、过氧化氢、硫酸、吐温-20、抗黄曲霉毒素B1的特异性单克隆抗体（或抗血清）、AFTBl与载体蛋白（牛血清白蛋白或多聚赖氨酸等）的结合物、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG等。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 （2）ELISA缓冲液系统 包被缓冲液（pH96的碳酸盐缓冲液）的制备 Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g、加蒸馏水至1000mL。磷酸盐缓冲液（pH7.4 PBS）的制备 KH2PO4 0.2g、Na2HPO412H2 2.9g、NaCI 8.0g、KCI 0.2g、加蒸馏水至1000mL。洗液（PBS-T）的制备 PBS加0.05（V/

35、V）吐温-20；抗体稀释液的制备 牛血清白蛋白（BSA）1.0g加PBS-T至1000mL。底物缓冲液（pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液）的制备食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 A液（0.1mol/L柠檬酸水溶液）柠檬酸（C6H8O，H2O）21.01g,加蒸馏水至1000mL。B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）Na2HP0412H20 716g,加蒸镏水至1000mL。用前按A液+B液+蒸馏水=24.3+25.7+50的比例（体积比）配制。封闭液的制备 牛血清白蛋白（BSA）1.0g加PBS-T至1000mL。终止液 2mol/L 硫酸。食品中微生物毒素的测定技术食品

36、中微生物毒素的测定技术 （3）黄曲霉毒素B1的标准溶液 用甲醇将AFTB1配制成lmg/mL的溶液，再用甲醇-PBS溶液（20+80）稀释至约10g/mL，用紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的光密度值，带入下式计算，计算该溶液中AFTB1的浓度。X=式中：X该溶液中AFTB1的浓度，g/mL；A测得的光密度值；MAFTB1的分子量，312；E摩尔消光系数，21800；f 使用仪器的校正因素。根据计算将该溶液配成10g/mL标准溶液，检测时，用甲醇-PBS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。EfMA1000食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 4 4测定步骤测定步骤 （1）取样（同第

37、一法）（2）提取 大米和小米（脂肪含量3.0）的提取）试样粉碎后过20目筛，称取200g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加人60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中。立即取12mL滤液（相当4.0g试样）于75mL蒸发皿中，65水浴通风挥干。用2.0mL20甲醇-PBS分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g试样。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 玉米的提取（脂肪含量3.05.0）试样粉碎后过20目筛，称取200g，加

38、入250mL具塞锥形瓶中，准确加入500mL甲醇-水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇-水溶液于50mL烧杯中，从中取10.0mL（相当于40g试样）于75mL蒸发皿中。（以下按自“65水浴通风挥于”起依法操作。）食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 花生的提取（脂肪含量15.045.0）试样去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中，准确加入100.0mL甲醇-水（55+45）溶液和30mL石油醚，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30min。

39、静置15min后用快速定性滤纸过于125mL分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇-水溶液于100mL烧杯中，从中取20.0mL（相当于4.0g试样）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层），放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中。再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷一并于蒸发皿中，（以下按自“65水浴通风挥于”起依法操作。）食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 植物油的提取 用小烧杯称取4.0g试样，用20.0mL石油醚，将试样移于125mL分液漏斗中，用20.0mL甲醇-水（55+45）溶

40、液分次洗烧杯，溶液一并移于分液漏斗中（精炼油4.0g样为4.525mL，直接用移液器加入分液漏斗，再加溶剂后振摇），振摇2min。静置分层后，放出下层甲醇-水溶液于75mL蒸发皿中，再用5.0mL甲醇-水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，（以下按自“65水浴通风挥于”起依法操作。）食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 （3）ELISA测定 将已知抗原吸附在固态载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品（含有抗原）提取液的混合液，竞争培养后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体

41、复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 包被微孔板 用AFTBl-BSA人工抗原包被酶标微孔板，150L/孔，4过夜。抗体抗原反应 将AFTBl纯化单克隆抗体稀释后，分别与等量不同浓度的AFTBl标准溶液和试样提取液，分别用2mL试管混合振荡后，4静置。前者用于制作AFTBl标准抑制曲线；后者用于测定试样中AFTBl含量。封闭 已包被的酶标板用洗液洗3次，每次3min后，加封闭液封闭，250L/孔，置37下1h。食品中微生物毒素的测定技术食

42、品中微生物毒素的测定技术 测定 酶标板洗33min后，加抗体抗原反应液（在酶标板的适当孔位加抗体稀释液或Sp2/0培养上清液作为阴性对照）130L/孔，37，2h。酶标板洗33min，加酶标二抗（1:200，v/v）100L/孔，1h。酶标板用洗液洗53min。加底物溶液（10mgOPD），加25mL底物缓冲液，加37L 30H202，100L/孔，37，15min，然后加2mol/L H2SO4，40L/孔，以终止显色反应，酶标仪490nm，测出被检测物吸收掉的光密度（OD值）。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 （4）结果计算 黄曲霉毒素Bl的浓度按下式进行计算。AFTB

43、l浓度（ng/g）=式中：C酶标微孔板上所测得的AFTBl含量，ng（纳克），对应标准曲线按数值插入法求得；Vl样品提取液的体积，mL；V2滴加样液的体积，mL；D稀释倍数；M2试样质量，g。mVVDC2211食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 由于按标准曲线直接求得的AFTBl浓度（C1）的单位为纳克每毫升（ng/g），而测孔中加入的试样提取的体积为0.065mL，所以公式中 C=0.065mLCl 而Vl2mL，V=0.065mL，D2，m24g代人公式，则 黄曲霉毒素B1浓度（ng/g）0.065Cl =Cl（ng/g）所以，在对试样提取完全按本方法进行时，从标准曲线直

44、接求得的数值Cl，即为所测试样中黄曲霉毒素Bl的浓度（ng/g）。注意：ELISA法可检测范围在ng至pg水平，属于超微量分析技术。它对试剂、蒸馏水、抗原抗体比例、微孔板以及实验各步骤的反应条件和操作，都有严格要求。412065.02食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 三、食品中黄曲霉毒素三、食品中黄曲霉毒素B B1 1 B B2 2 G G1 1 G G2 2总量的测定总量的测定 （一）薄层色谱法（一）薄层色谱法 1 1原理原理 试样经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下，黄曲霉毒素B1 B2产生蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G1 G2产生黄绿色荧光，根据其在薄层板上显

45、示的荧光的最低检出量来定量。2 2试剂试剂 （1）试剂 三氯甲烷、正己烷或石油醚（沸程3060或6090）、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚（经无水硫酸钠脱水）、丙酮。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、硫酸（1+3）、硅胶G（薄层色谱用）。苯-乙腈（98+2）混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混匀。甲醇-水（55+45）溶液：量取55mL甲醇，加45mL蒸馏水，混匀。苯-乙醇-水（46+35+19）展开剂：取此比例配制的溶液置于分液漏斗中，振摇5min，静置过夜。将上下层溶液分别置于具塞瓶中保存，上下层交界的溶液弃去。若出现混浊，则在80水浴

46、上加热，待清晰后即停止加热，取上层溶液作展开剂用。另取一定量下层溶液置小皿中，再放于展开槽内。将薄层板放入展开槽内，预先饱和10min后展开。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 （2）黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2标准溶液 单一标准溶液（10g/mL）准确称取黄曲霉毒素B1 和 G1标准品各11.2mg，黄曲霉毒素B2 和 G2标准品各0.50.6mg，用苯-乙腈混合液作溶剂配制。黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2的分子量及用苯-乙腈混合液作溶剂时的最大吸收峰的波长及摩尔消光系数见表5-4。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 黄曲霉毒素混合标准使用液 每毫升

47、相当于0.2g黄曲霉毒素B1、G1及0.1g黄曲霉毒素B2、G2，作定位用。黄曲霉毒素混合标准使用液 每毫升相当于0.04g黄曲霉毒素B1、G1及0.02g黄曲霉毒素B2、G2，作最低检出量用。（3）消毒液 50g/L次氯酸钠溶液 称取100g漂白粉精，加入500mL水，搅拌均匀。另将160g工业用碳酸钠（Na2CO310H2O）溶于500mL温水中。再将两液混合、搅匀，澄清后过滤，贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，作为AFTB1消毒剂。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 3 3主要仪器主要仪器 小型粉碎机、分样筛、电动振荡器、全玻璃浓缩器或250mL索氏抽提器、玻璃板（5cmX20

48、cm）、薄层板涂布器、展开槽（内长25cm、宽6cm、高4cm）、紫外光灯（lOO125W，带有波长365nm滤光片）、微量注射器或血色素吸管等。4 4操作步骤操作步骤 （1）取样、样品预处理。（同AFTB1）（2）测定 A单向展开法 薄层板的制备 称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量23倍左右的水，用力研磨l2min,至成糊状后立即倒于涂布器内，推成5cm20cm，厚度约0.25mm的薄层板三块。在空气中干燥约15min后，在100下活化2h，取出放干燥器中保存。一般可保存23天，若放置时间较长，可再活化后使用。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 点样 将薄层板边缘附着的吸附剂

49、刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为lcm，点直径约3mm。在同一块板上滴加样点的大小应一致，滴加时可用吹风机的冷风边点边吹。滴加的4个样点如下：第一点：lOL黄曲霉毒素混合标准使用液。第二点：20L样液。第三点：20L样液+lOL黄曲霉毒素混合标准使用液。第四点：20L样液+lOL黄曲霉毒素混合标准使用液。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 展开与观察 黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2的比移值依次排列为B1 B2 G1 G2。在展开槽内加lOmL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加lOm

50、L丙酮-三氯甲烷（8+92），展开lO12cm，取出。在紫外光下观察结果，方法如下:由于样液点上加滴黄曲霉毒素混合标准使用液或，可使黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2分别与样液的黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2依次为0.0004、0.0002、0.0004、0.0002g，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2的最低检出量是否正常出现。如为阳性，则起定位作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2依次为0.002、0.001、0.002、0.001g，主要起定位作用。若第二点在与黄曲霉毒素B1 B