医学精资料20111160-分子生物学订正.doc

1、2简述第二代测序技术的原理和应用。第二代测序技术即焦磷酸测序技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。其原理为：第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)；第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)；第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP

2、；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比；第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。第5步：加入另一种dNTP，使第24步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。10. 简述乳糖操纵元的基本调控方式。正调控和负调控是原核生物转录水平调控的两种主要方式，大肠杆菌体内存在多种操纵子，各种操纵子都是通过正调控因子和负调控因子进行复合调控，如大肠杆菌的乳糖操纵子是在阻遏蛋白的负性调控和代谢物基因激活蛋白CAP的正性调控下

3、进行的：1) 阻遏蛋白的负性调控：乳糖操纵子有三个结构基因Z、Y、A，分别编码-半乳糖苷酶、透酶、-半乳糖苷乙酰化酶，结构基因上游有一个启动子和一个操纵元件。在启动子上游有一个CAP结合位点。启动子、操纵元件、CAP结合位点共同构成了乳糖操纵子的调控区。I基因是调节基因，编码阻遏蛋白。阻遏蛋白以四聚体形式与操纵元件结合，从而抑制RNA聚合酶与启动子的结合，最终抑制结构基因的转录。但偶有阻遏蛋白与操纵元件解聚，使得每个细胞中会有很少的-半乳糖苷酶和透酶产生，即本底表达。当有乳糖存在时，乳糖经透酶进入细胞，在-半乳糖苷酶是催化下生成半乳糖，半乳糖作为诱导剂与阻遏蛋白结合继而解除其对结构基因的转录抑

4、制作用。2）代谢物基因激活蛋白CAP的正性调控：由于乳糖操纵子的lac启动子是弱启动子，RNA聚合酶与其结合的能力较弱，只有CAP结合到启动子上游的CAP结合位点后，促进RNA聚合酶与启动子结合，从而有效激活转录，该过程即为CAP对乳糖操纵子的正性调控作用。3) 正、负调控的相对性：由于大肠杆菌存在两种调控机制，乳糖操纵子的转录起始由阻遏蛋白和CAP共同作用产生，二者因葡萄糖和乳糖的存在与否发生如下几个方面的相对性调控：a) 葡萄糖和乳糖都存在：乳糖的存在解除了阻遏蛋白对转录的抑制作用。葡萄糖的存在使细胞内cAMP水平降低，cAMP-CAP复合物不能形成而导致转录不能进行，基因处于关闭状态。b

5、) 葡萄糖存在、乳糖不存在：无诱导剂存在，阻遏蛋白与DNA结合阻遏基因转录。同时，由于葡萄糖的存在，CAP也不能发挥正调控作用，基因处于关闭状态。c) 葡萄糖和乳糖都不存在：虽然没有葡萄糖的存在时CAP发挥正调控作用，但由于无诱导剂的存在，阻遏蛋白的负调控作用依然是基因处于关闭状态。d) 葡萄糖不存在、乳糖存在：此时CAP发挥正调控作用，同时由于诱导剂的存在，阻遏蛋白失去负调控作用，基因被打开，启动转录。16.简述原核生物基因转录过程并举例说明抗生素的原理。原核生物基因转录过程包括：模板识别，转录起始，转录延伸和转录终止四个过程。模板识别阶段：RNA聚合酶与启动子相互作用，使启动子附近的DNA

6、双链分开形成转录泡；转录起始：转录泡促使底物dNTP与模板DNA的碱基配对，合成RNA链上的核苷酸；转录延伸：当合成了的RNA链上的 9个核苷酸时，RNA聚合酶离开启动子沿着DNA链移动并使新生的RNA链不断延伸；转录终止：当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，RNA聚合酶和RNA链都从模板上释放出来而终止转录。抗生素作用原理：抑制细胞壁的形成，如青霉素，主要是抑制细胞壁中肽聚糖的合成。多氧霉素（一种效果很好的杀真菌剂）主要作用是抑制真攻细胞壁中几丁质的合成；影响细胞膜的功能，如多粘菌至少与细胞结合，作用

7、于脂多糖、脂蛋白，因此对革兰氏阴性菌有较强的杀菌作用，制霉菌素与真菌细胞膜中的类固醇结合，破坏细胞膜的结构；干扰蛋白质的合成，通过抑制蛋白质生物合成抑制微生物生长的抗生素较多，如卡那霉素、链霉素等；阻碍核酸的合成，主要通过抑制DNA或RNA的合成，抑制微生物的生长，例如利福霉素、博莱霉素等。17,简述蛋白质合成的自体调控。自体调控与组蛋白密码不是一个概念翻译过程中的自体调控。1. 阻抑蛋白对翻译起始的调控。阻抑蛋白通过与mRNA的特定区域结合，抑制核糖体对翻译起始区的识别。这种调控最常见的形式是，调控蛋白与含有起始密码子AUG的序列直接结合，从而阻止核糖体的结合。2. mRNA二级结构对翻译的

8、调控。翻译一个顺反子需要二级结构的改变，而这种二级结构的改变又依赖于前一个顺反子的翻译。第一个顺反子的翻译破坏原有的二级结构，使核糖体能够与下一个顺反子的翻译起始区域结合。3. 基因表达装置蛋白质合成的自体调控。一种蛋白质或RNA调控其自身的表达，即为自体调控。细菌编码核糖体蛋白质、蛋白质合成因子和RNA聚合酶亚基等蛋白质的基因混合组成几个操纵子。每个操纵子都含有数个基因。这些操纵子的表达都受操纵子自身的一些基因产物的调控。操纵子自身编码的蛋白质的富集会抑制其自身及一些相关基因产物的进一步合成。12简述TAP-MS技术原理及应用。（本题不参与考试，感兴趣的可以看下）串联亲和纯化技术(tande

9、m afinity purification，TAP)是近年来发展的一种能够快速研究生理条件下蛋白质相互作用、揭示蛋白质复合体相互作用网络的新技术，如今已经成为研究蛋白质组学的一个被广泛采纳的工具。此技术使用特别设计的纯化标签在非常接近于生理条件的情况下，能捕捉出特定的蛋白质及其作用伙伴，借助于质谱分析技术，研究人员即可鉴别出这种蛋白质相互作用组。标签共分3部分：蛋白A、钙调素结合多肽(calmodulin binding peptide。CBP)和中间连接的烟草病毒(TEV)蛋白酶识别的酶切位点。 带有TAP标签的融合蛋白在细胞中表达，且与内源相互作用蛋白形成复合物，细胞裂解后经IsG偶联的

10、层析柱纯化，蛋白A与IgG特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化。为除去与柱填料非特异结合的蛋白，用TEv酶切割分离蛋白A标签，使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离，并经过钙调素偶联的亲和层析柱进行第二次纯化，靶蛋白上的CBP标签可与钙调素结合；在加入过量螯合剂后CBP与亲和层析柱分离使含有靶蛋白的复合体得到分离纯化，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，复合物中的各个蛋白被分开，切胶、胰酶消化后，即可通过质谱鉴定复合物中各个蛋白的氨基酸序列。该方法的优点：(1)不需要过多的背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体。(2)蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平。是一种检测体内蛋白相互作用的方法。(3)TAP采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性。1. Omics是一个相对较大的概念，指从整体水平研究生物学某个领域的变化及调节，常见组学包括病理基因组学、生殖基因组学、环境基因组学、毒物基因组学、营养基因组学、比较基因组学、表基因组学、干细胞基因组学、RNA组学、蛋白质组学、转录组学、代谢物组学、临床基因组学、化学基因组学、调节基因组学、计算机功能基因组学、基因组动力学、功能基因组学等。但是，我们也应该看到，随着组学概念的提出，组学一词的应用有些泛滥。