第05章代谢物酶法分析技术课件.ppt

1、2代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。酶法分析（酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。代谢物酶法分析技术的概念代谢物酶法分析技术的概念3 代谢物酶法分析代谢物酶法分析 平衡法（终点法）平衡法（终点法）速率法（动力学法）速率法（动力学法）代谢物酶法分析的理论基础代谢物酶法分析的理论

2、基础14平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%5%）时，）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法(end-point method)。平衡法的特点是测定底物的总变化量，平衡法的特点是测定底物的总变化量，即测定的是即测定的是“浓度浓度”。平衡法基本理论平衡法基本理论(1)5速率法速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是又称动力学法、连续监测

3、法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时当底物的消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度（v）与代测物的浓度成正与代测物的浓度成正比例。比例。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。速率法基本理论速率法基本理论(2)6在临床操作中，只要测定期间待测物消耗在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 Km2，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学。呈一级反应动力学。但在以但在以NADH 或

4、或NADPH 为底物的终点法测定中，因为底物的终点法测定中，因340 nm 吸光度吸光度的限制，辅酶的用量不可能过的限制，辅酶的用量不可能过高。高。12在在340 nm 处测定吸光度的处测定吸光度的增加来进行定量的方法增加来进行定量的方法乳酸测定乳酸测定双底物反应直接测定法双底物反应直接测定法 LD乳酸乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+丙酮酸测定丙酮酸测定 在在340 nm 处测定吸处测定吸光度的下降来进行定量的方法光度的下降来进行定量的方法 乳酸乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LD13酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从酶促反应的底物或

5、产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。而达到检测目的的方法称酶促偶联法。最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。ACBAEiEa 酶偶联法酶偶联法(2)14脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 氧化型辅酶氧化型辅酶NAD(P)+在在340 nm 处没有吸处没有吸收峰收峰,还原型辅酶还原型辅酶NAD(P)H在在340 nm 处有吸收峰处有吸收峰.15脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶以脱氢

6、酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶(NAD+)或氧化型辅酶或氧化型辅酶(NADP+)变为还原变为还原型型NAD(P)H后在后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型将还原型NAD(P)H 变为氧化型变为氧化型NAD(P)+，测定，测定340 nm 处吸光度的下降来计算被测物的浓度。处吸光度的下降来计算被测物的浓度。16脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 血清葡萄糖己糖激酶法测定血清葡萄糖己糖激酶法测定 Glu+ATPG-6-P+ADPPDG 6G-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指

7、示酶反应将指示酶反应将NADP+转化为转化为NADPH+H+，测定，测定340 nm吸光度上升的吸光度上升的速度与葡萄糖的含量速度与葡萄糖的含量成正比成正比 17脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 血清尿素测定血清尿素测定 尿素尿素+H2O 尿素酶2NH3+CO2NH3+-酮戊二酸酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸谷氨酸+H2O+NAD+测定测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定测定 18常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、

8、苹果酸脱氢酶等。磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示系统。系统。脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 19过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统 共用的指示反应最早由共用的指示反应最早由Trinder氏等人提出，被称为氏等人提出，被称为Trinder反反应应 最大吸收峰为最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、，在可见光范围内比色。

9、已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定甘油三酯等项目的测定 20过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统 血清总胆固醇氧化酶测定法血清总胆固醇氧化酶测定法 COD胆固醇酯胆固醇酯+H2O胆固醇胆固醇+O2胆固醇胆固醇+脂肪酸脂肪酸4-胆甾烯酮胆甾烯酮+H2O2红色醌类化合物红色醌类化合物H2O2+4-AAP+酚酚指示酶反应生成的红色醌类指示酶反应生成的红色醌类化合物可在化合物可在500 nm 处比色测定处比色测定 21化学名化学名英文缩写英文缩写最大吸收峰（最大吸收峰（nm）酚酚2，4-二氯酚二氯酚N-乙基乙基-N-（3-甲苯）甲苯）-N-乙酰乙二胺乙酰乙二胺N-乙基乙基-N-

10、（2-羟基羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺丙磺酰）间甲苯胺N-乙基乙基-N-（3-丙磺酰）丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统 常用的常用的Trinder反应生色基团反应生色基团 表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有些生色基表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶血等色素干扰。团的产物是兰色醌类，能避免溶血等色素干扰。22利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物

11、不断扩增，扩增量决定于循环次数，利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。酶循环法酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶决于两种试剂酶(Ea 和和Eb)的量。该法测定中所选择酶的的量。该法测定中所选择酶的Km 值要小，以便用较少的酶量保持所值要小，以便用较少的酶量

12、保持所需的灵敏度。需的灵敏度。酶循环法酶循环法(3)23使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或或其衍生物其衍生物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。或靶物质的氧化产物作为底物循环。检测指示系统：检测指示系统：循环前、后用速率法测定循环前、后用速率法测定NADH(340 nm)的变化。检测产物的变化。检测产物H2O2可可通过通过Trinder 反应比色测定。反应比色测定。产物循环氧化酶脱氢酶系统产物循环氧化酶脱氢酶系统 24产物循环氧化酶脱氢酶系统产物循环氧化酶脱氢酶系统

13、甘油浓度测定 通过通过GPO和和G-3PDH使使G-3P 与与DHAP之间循环，在反复循环中之间循环，在反复循环中G-3P 和和DHAP 的量不变，而产物的量不变，而产物H2O2 随每随每次循环不断递增，同时次循环不断递增，同时NADH 递减。在规定时间递减。在规定时间t 内，内，H2O2 累计的量决定于累计的量决定于t 和每和每min循环次数。循环次数。25底物循环脱氢酶辅酶系统底物循环脱氢酶辅酶系统用一种脱氢酶和两种辅酶用一种脱氢酶和两种辅酶(thio-NAD+和和NADH)。用。用395 nm 415 nm 波长测定反应中氧化型波长测定反应中氧化型thio-NAD+转为还原型转为还原型t

14、hio-NADH的增加的增加速度。速度。循循环反应条件：环反应条件：酶对酶对thio-NAD+和和NADH应有高度亲和力。应有高度亲和力。溶液溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。和缓冲体系同时有利于双向反应。thio-NAD+和和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。二者的浓度和配比达最适条件。26底物循环脱氢酶辅酶系统底物循环脱氢酶辅酶系统血淸胆汁酸测定血淸胆汁酸测定 胆汁酸与胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶（黄色），控制好条件，反应速度（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。与代测物胆汁

15、酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。27氨循环合成酶脱氢酶系统氨循环合成酶脱氢酶系统 NH4+在在NAD合成酶和合成酶和Mg2+存在下催化脱氨存在下催化脱氨-NAD转化为转化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和酸和NH4+同时生成同时生成NADH，生成的，生成的NH4+进入循环再次生成进入循环再次生成NADH，在，在340nm测定。测定。28酶循环法具有的特点酶循环法具有的特点 灵敏度随反应时间的延长而提高灵敏度随反应时间的延长而提高灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高利用酶对底物的特异性利用酶对底物的特异性,使测定系统简化使

16、测定系统简化利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定 29酶活性恢复法酶活性恢复法 很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微微量元素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。量元素或辅酶使该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元

17、素或辅酶的含量。其他酶法其他酶法(4)30异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 酶活性恢复法酶活性恢复法MgDIC异柠檬酸异柠檬酸+NADP+-酮成二酸酮成二酸+CO2+NADPH+H+用用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA)抑制钙离子，标本中抑制钙离子，标本中Mg2+通过恢复通过恢复ICD 活性，催化异柠檬活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使酸脱氢的正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在还原，与镁标准一起在340nm测定吸光度的増加。测定吸光度的増加。31酶活性恢复法应用举例酶活性恢复法应用举例丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子丙

18、酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子-半乳糖苷酶法测定钠离子半乳糖苷酶法测定钠离子淀粉酶法测定氯离子淀粉酶法测定氯离子超氧化物歧化酶法测定铜离子超氧化物歧化酶法测定铜离子碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等 32激活和抑制法激活和抑制法 有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37水浴水浴10min，测定剩余的，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量。乙酰胆碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量。有机磷的酶法测定有机磷的

19、酶法测定根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。含量。另有抑制另有抑制ALP法测定茶碱、激活法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。法测定镁离子等。返回章目录返回章目录33试剂酶质量试剂酶质量试剂酶概念试剂酶概念 试剂酶特征试剂酶特征 试剂酶纯度试剂酶纯度酶法设计要求酶法设计要求 酶法设计共性要求酶法设计共性要求 平衡法设计的要求平衡法设计的要求 速率法设计的要求速率法设计的要求 代谢物酶法分析的设计要求代谢物酶法分析的设计要求 3试剂酶来源试剂酶来源34试剂酶是指作为诊断试剂来测定化

20、合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。它的质量是酶试剂质量的决定性因素。试剂酶的质量要求试剂酶的质量要求(1)试剂酶的概念试剂酶的概念35主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。杂酶含量少且价格低廉。不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适、最适

21、pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。试剂酶的来源和理化特征试剂酶的来源和理化特征试剂酶的质量要求试剂酶的质量要求(1)36不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在有较高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。反应中要求相对低一些。纯度主要指标纯度主要指标 酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。杂酶含量，容易引起副反酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。杂酶含量，

22、容易引起副反应的一些酶含量按应的一些酶含量按“允许限度允许限度”的要求（见表的要求（见表5-2）。）。试剂酶的质量要求试剂酶的质量要求(1)试剂酶的纯度要求试剂酶的纯度要求37表表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求常用试剂酶的理化特征及质量要求 名称名称来源来源分子量分子量等电点等电点比活性比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性的杂酶占试剂酶活性的%（允许限（允许限度）度）葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（GOD）A.nigerp.notatum1860001520004.3020蔗糖酶含量0.01%,过氧化氢酶10U/mg蛋白己糖激酶己糖激酶(HK)酵母1050004.50-4.80140磷酸葡萄糖异

23、构酶0.01%,G-6-P脱氢酶0.01%葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸脱磷酸脱氢酶氢酶(G-6-PDH)酵母2120004.50140己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶0.02%过氧化物酶过氧化物酶(POD)辣根402007.2050不含胺氧化酶及过氧化氢酶38名称名称来源来源分子量分子量等电点等电点比活性比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性的杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）（允许限度）脲酶脲酶巨豆483 0004.905-100天冬氨酸酶0.02%,精氨酸酶0.002%,NH4+0.0005g/U,谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶(GLDH)变形杆菌300 0004.6090醇脱氢酶、乳酶脱氢酶、苹果酸脱氢酶0

24、.01%乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 心135 0004.5-4.8500丙氨酸转氨酶0.01%,丙酮酸激酶、醛缩酶0.001%脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶（LPL）心，假单胞菌属47 0005.950.05100ATP酶0.00008%,NADH氧化酶0.001%,胆固醇氧化酶0.002%,过氧化氢酶0.02%甘油激酶（甘油激酶（GK)嗜热脂肪芽胞杆菌209 000 85NADH氧化酶0.01%,己糖激酶0.02%39名称名称来源来源分子量分子量等电点等电点比活性比活性(U/mg)杂酶占试剂酶活性的杂酶占试剂酶活性的%（允许限度）（允许限度）磷酸磷酸-3-甘油氧化酶甘油氧化酶足球菌76 0004.60.

25、140乳酸氧化酶0.001%胆固醇酯酶胆固醇酯酶(CEH)假单胞菌302000 25ATP酶0.00008,NADH氧化酶0.001%,GOD0.00001%,尿酸酶0.00004%,过氧化氢酶1U/mg胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶(CHOD)链霉菌340005.1-5.425CEH0.005%,GOD0.00014%尿酸酶0.0004%胆红素氧化酶胆红素氧化酶(BOD)疣胞漆斑菌520004.100.2NADH氧化酶0.0007%尿酸酶尿酸酶肝1000006.3015过氧化氢酶1.0%丙酮酸氧化酶丙酮酸氧化酶 2600004.301.5ATP酶0.05%，ALT、AST0.05%40所用试剂酶的

26、特异性：所用试剂酶的特异性：怎样消除干扰因素：怎样消除干扰因素：试剂中的附加剂：试剂中的附加剂：如何提高灵敏度：用如何提高灵敏度：用PMS或黄递酶，将或黄递酶，将NADH上的氢交给四氮唑盐，在可见光监测；上的氢交给四氮唑盐，在可见光监测；用酶循环法；用酶循环法；测定荧光法。测定荧光法。酶法分析的设计要求酶法分析的设计要求(2)酶法设计的共性要求酶法设计的共性要求41酶的用量要足够大，能使反应酶的用量要足够大，能使反应1 min3 min 达到平衡，以保证较快完成测定。达到平衡，以保证较快完成测定。反应要朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、反应要朝正反

27、应方向进行，如果反应的平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应改变反应pH 等方法等方法,并设标准管一起到达平衡以后测定。并设标准管一起到达平衡以后测定。Km 在保证测定线性的前提下要尽量小。在保证测定线性的前提下要尽量小。平衡法设计的要求平衡法设计的要求42所用酶的所用酶的 Km 应足够大，以保证测定线性和较长的反应动态期。应足够大，以保证测定线性和较长的反应动态期。Km 太小，可加入竞争性抑制剂加太小，可加入竞争性抑制剂加大大 Km。酶用量要合适，用少了可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。一般认为酶用量比平衡法小。酶用量要合适，用少了可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧

28、失。一般认为酶用量比平衡法小。速率法酶促反应受很多因素影响，只有很好控制反应速度（速率法酶促反应受很多因素影响，只有很好控制反应速度（v）才与代测物的浓度成正比例。）才与代测物的浓度成正比例。速率法设计的要求速率法设计的要求43区别区别速率法速率法平衡法平衡法测定时间测定时间检测速度检测速度检测成本检测成本产物堆积产物堆积样品色原样品色原测定仪器测定仪器较较短短较较快快酶用量小，成本低酶用量小，成本低影响较小影响较小影响较小影响较小要求电噪声小，要求电噪声小，A读准到读准到0.0001，温差，温差0.1%较长较长较较慢慢酶用量大，成本酶用量大，成本高高影响较大影响较大影响较大影响较大要求不严要求不严 速率法和平衡法测定比较速率法和平衡法测定比较另外，平衡法的试剂酶活性下降对测定影响远没有速率法明显，仅使达到平衡所需时间延长，检测范围变另外，平衡法的试剂酶活性下降对测定影响远没有速率法明显，仅使达到平衡所需时间延长，检测范围变窄。但对速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。由于以上种种原因，代谢物酶法分析大窄。但对速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。由于以上种种原因，代谢物酶法分析大多选择平衡法。多选择平衡法。返回章目录返回章目录