生化实验技术综合设计性大实验精选课件.pptx
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- 生化 实验 技术 综合 设计 精选 课件
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1、l实验实施要求实验实施要求:平时按各组计划时间分:平时按各组计划时间分别进行实验,组长有义务指导下组相关别进行实验,组长有义务指导下组相关实验内容,每次实验必须登记。实验内容,每次实验必须登记。l全班交流全班交流:实验结束安排课堂讨论交流,:实验结束安排课堂讨论交流,每组准备一人汇报,一人记录;要求用每组准备一人汇报,一人记录;要求用PPTPPT总结汇报项目实施、实验创新、疑难总结汇报项目实施、实验创新、疑难点,其他组学生质疑,教师点评。点,其他组学生质疑,教师点评。l指导教师指导教师:汪财生、斯越秀:汪财生、斯越秀l通过综合训练,能够系统掌握蛋白质、通过综合训练,能够系统掌握蛋白质、DNA制
2、备的基本原理和操作,学习如何制备的基本原理和操作,学习如何进行实验设计,掌握实验过程中的关键进行实验设计,掌握实验过程中的关键环节,对实验中出现的问题进行科学的环节,对实验中出现的问题进行科学的分析;在学习实验技术的同时,自觉培分析;在学习实验技术的同时,自觉培养分析问题和解决问题能力。养分析问题和解决问题能力。实验项目训练目标实验项目训练目标思考题(课前设疑)思考题(课前设疑)1.1.如何保持生化物质的生物活性?一般生化物如何保持生化物质的生物活性?一般生化物质在碱性条件下容易变性,还是在酸性条件质在碱性条件下容易变性,还是在酸性条件下容易变性?下容易变性?2.2.一般从天然生物材料制作生化
3、物质的过程大一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为几个阶段?体可分为几个阶段?3.3.在制备生化物质前应如何选择原料?在制备生化物质前应如何选择原料?4.4.什么叫动态吸附和静态吸附?它们在应用什么叫动态吸附和静态吸附?它们在应用上有何区别?上有何区别?5.5.对酸性物质的提取,常在什么条件下进行?对酸性物质的提取,常在什么条件下进行?对碱性物质的提取,常在什么条件下进行?对碱性物质的提取,常在什么条件下进行?对两性物质的提取,常在什么条件下进行?对两性物质的提取,常在什么条件下进行?6.6.以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的基本原理?基本原理?7
4、.7.干燥离子交换剂应如何进行处理?何谓干燥离子交换剂应如何进行处理?何谓离子交换剂转型?离子交换剂转型?8.8.动植物总动植物总DNADNA或或RNARNA提取的方法主要有哪提取的方法主要有哪些?以猪脾脏些?以猪脾脏DNADNA提取为例试述每步骤主提取为例试述每步骤主要原理是什么?如何判断所提取要原理是什么?如何判断所提取DNADNA的纯的纯度?度?9.9.蛋白质浓度测定方法有哪些?如何鉴定蛋白质浓度测定方法有哪些?如何鉴定所提取蛋白的纯度?未知蛋白质分子量所提取蛋白的纯度?未知蛋白质分子量测定方法有哪些?测定方法有哪些?l11-1411-14周周 生物技术生物技术072-073072-07
5、3班实验班实验l14-1614-16周周 生物技术生物技术071071班实验班实验l1515周周 生物技术生物技术072-073072-073班上交班上交 论文及讨论材料等论文及讨论材料等l1717周周 生物技术生物技术071071班上交论文班上交论文 及讨论材料等及讨论材料等 生化物质的制备分析生化物质的制备分析利用生化制备技术从生物材料中获得特殊的生物活性物质,如蛋白质、酶、激素、核酸等生化产品时,通常要注意以下几个问题:亲和层析法具有从复杂生物组成中专一的“钓出”特异生化成分的特点,目前已在生物大分子,如酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中得到广泛应用。细菌DNA,除核DNA 外,还有质粒DN
6、A 等。(2)制备物的理化性质稳定性的预备试验;微生物中,谷氨酸菌体含7%10%,面包酵母含4%,啤酒酵母含6%,大肠肝菌含9%10%。溶剂用量(L)为生物材料的25倍,少数情况也有用1020倍量溶剂作一次性提取。气体萃取剂必须具有临界压力低,临界温度接近于室温,化学稳定性好,价廉易得等特点。(三)分离纯化方法的评估分别加柠檬酸钠和EDTA的作用是什么?细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎细胞。-球蛋白也称为丙种球蛋白,相对分子量为15-16万,沉降系数为7S;(3)材料处理及抽提方法的选择;如从病毒中提取DNA 比较容易,多数病毒DNA 分子量较小,提取时易保持其结构完整性。结合本人实验操作的体会
7、,试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂?分级盐析法分离纤维蛋白、球蛋白和清蛋白的依据是什么?除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。指导教师:汪财生、斯越秀较常用的有十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异,从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取(extraction),提取又称萃取或抽提,其含义基本相同。一般从天然生物材料制作生化物质一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段:的过程大体可分为六个阶段:1.1.原料的选择和预处理原料的选择和预处理 2.2.原料的粉碎;原料的粉碎;3.3.提取,即从
8、原料中经溶剂分离有效成分,制成粗提取,即从原料中经溶剂分离有效成分,制成粗 品的工艺过程;品的工艺过程;4.4.纯化,即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、纯化,即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行 精制的工艺过程;精制的工艺过程;利用生化制备技术从生物材料中获得利用生化制备技术从生物材料中获得特殊的生物活性物质,如蛋白质、酶、特殊的生物活性物质,如蛋白质、酶、激素、核酸等生化产品时,通常要注意激素、核酸等生化产品时,通常要注意以下几个问题:以下几个问题:6.6.成品及制剂成品及制剂,即半成品或原料药经精细加工制
9、成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。5.5.干燥及保存干燥及保存;1 1生物材料的组成成分非常复杂,生物材料的组成成分非常复杂,有数百种甚至更多,各种化合物的形有数百种甚至更多,各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同,有的迄今还是未知物,都各不相同,有的迄今还是未知物,而且这些化合物在分离时仍在不断的而且这些化合物在分离时仍在不断的代谢变化中。代谢变化中。1生物材料的组成成分非常复杂,有数百种甚至更多,各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同,有的迄今还是未知物,而且这些化合物在分离时仍在不断的代谢变化中。
10、在学习实验技术的同时,自觉培养分析问题和解决问题能力。机械方法:超声波处理法、研磨法、一般要注意以下几个方面:利用液体比重的大小分离出不同比重的液体者为离心分离;以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的基本原理?免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是人体接受抗原刺激后,由浆细胞所产生的一类具有免疫功能的球状蛋白质,是直接参与免疫反应的抗体蛋白的总称。选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。干燥离子交换剂应如何进行处理?何谓离子交换剂转型?5原料解剖学部位分别加柠檬酸钠和EDTA的作用是什么?分别加柠檬酸钠和EDTA的作用是什么?该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取(如鱼
11、油和卵磷脂的提取)、精制和回收,也可用于生化产品的溶剂脱除。动物的脏器组织,常用绞肉机机械法粉碎;11-14周 生物技术072-073班实验通过综合训练,能够系统掌握蛋白质、DNA制备的基本原理和操作,学习如何进行实验设计,掌握实验过程中的关键环节,对实验中出现的问题进行科学的分析;利用液固两相比重的差异进行沉降分离者为离心沉降。实验实施要求:平时按各组计划时间分别进行实验,组长有义务指导下组相关实验内容,每次实验必须登记。溶剂用量(L)为生物材料的25倍,少数情况也有用1020倍量溶剂作一次性提取。(三)生化物质的提取掌握层析、透析、膜分离、电泳等生化分离鉴定技术的应用及操作对酸性物质的提取
12、,常在什么条件下进行?对碱性物质的提取,常在什么条件下进行?对两性物质的提取,常在什么条件下进行?2 2在生物材料中,有些化合物含量很低在生物材料中,有些化合物含量很低或极微,有的只有或极微,有的只有1 1l0 000l0 000,甚至更少。制,甚至更少。制备时,原材料用量很大,得到产品很少,与备时,原材料用量很大,得到产品很少,与投料量相比投料量相比“虎头蛇尾虎头蛇尾”。近年来,用所谓。近年来,用所谓“钓鱼法钓鱼法”,利用某些分子特有的专一亲和,利用某些分子特有的专一亲和力,将某一化合物从极复杂的体系中力,将某一化合物从极复杂的体系中“钓钓”出来,与其他化学分离技术相比具有很大的出来,与其他
13、化学分离技术相比具有很大的优越性。优越性。3 3许多生物活性物质,一旦离开了生物许多生物活性物质,一旦离开了生物体内环境,很易变性及被破坏,应十分注意保体内环境,很易变性及被破坏,应十分注意保护这些化合物生物的活性,常选择十分温和的护这些化合物生物的活性,常选择十分温和的条件,尽可能在较低温度和洁净环境中进行。条件,尽可能在较低温度和洁净环境中进行。一般来说制备的操作时间长、手续较繁琐。因一般来说制备的操作时间长、手续较繁琐。因为许多大分子在分离过程中,为许多大分子在分离过程中,过酸、过碱、重过酸、过碱、重金属离子、高温、剧烈的机械作用、强烈的辐金属离子、高温、剧烈的机械作用、强烈的辐射和机体
14、内自身酶的作用,均可破坏这些分子射和机体内自身酶的作用,均可破坏这些分子的结构或生理活性。的结构或生理活性。4 4生化分离制备过程几乎都在溶液中进生化分离制备过程几乎都在溶液中进行,各种温度、行,各种温度、pHpH、离子强度等参数,对溶、离子强度等参数,对溶液中各种组成的综合影响,常常无法固定,液中各种组成的综合影响,常常无法固定,有些实验或工艺的设计理论性不强,常带有有些实验或工艺的设计理论性不强,常带有很大的经验成分。因此,要建立重复性好的很大的经验成分。因此,要建立重复性好的成熟工艺,对生物材料、各种试剂及其辅助成熟工艺,对生物材料、各种试剂及其辅助材料等都要严格地加以规定。材料等都要严
15、格地加以规定。5 5生化制备方法最后生化制备方法最后均一性均一性的证明的证明与化学上与化学上纯度纯度的概念并不完全相同,这的概念并不完全相同,这是由于生物分子对环境反应十分敏感,是由于生物分子对环境反应十分敏感,结构与功能的关系比较复杂,评定其均结构与功能的关系比较复杂,评定其均一性时,要通过不同角度测定,才能得一性时,要通过不同角度测定,才能得出相对出相对“均一性均一性”结论,只凭一种方法结论,只凭一种方法所得纯度的结论,往往是片面的,甚至所得纯度的结论,往往是片面的,甚至是错误的。是错误的。原料选择和预处理原料选择和预处理 选什么样的原材料应视生产目的而定。选什么样的原材料应视生产目的而定
16、。一般要注意以下几个方面一般要注意以下几个方面:1 1要选择有效成分含量高的新鲜材料;要选择有效成分含量高的新鲜材料;2 2来源丰富易得;来源丰富易得;3 3制造工艺简单易行;制造工艺简单易行;4 4成本比较低;成本比较低;5 5经济效果要好。经济效果要好。如蛋白质原料的选择如蛋白质原料的选择 蛋白质类生化产品的原料来源有动植蛋白质类生化产品的原料来源有动植物组织和微生物等,原则是要选择富含所物组织和微生物等,原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。取的无害生物材料。对天然蛋白质生化产品,为提高其质对天然蛋白质生化产品,为提高
17、其质量、产量和降低生产成本,对原料的量、产量和降低生产成本,对原料的种属、种属、发育发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的都有一定的要求,了解这些,可使分离纯化工作事半要求,了解这些,可使分离纯化工作事半功倍,反之则收效甚微。功倍,反之则收效甚微。1 1种属种属 牛胰含胰岛素(牛胰含胰岛素(insulin)insulin)单位比猪单位比猪胰高,牛为胰高,牛为4000 IU4000 IUkgkg胰脏,猪为胰脏,猪为3000 IU3000 IUkgkg胰脏。抗原性则猪胰岛素胰脏。抗原性则猪胰岛素比牛胰岛素低
18、,前者与人胰岛素相比,比牛胰岛素低,前者与人胰岛素相比,只有只有1 1个氨基酸的差异,而牛有个氨基酸的差异,而牛有3 3个氨基个氨基酸的差异。酸的差异。2 2发育生长阶段发育生长阶段 幼年动物的胸腺比较发达,老龄幼年动物的胸腺比较发达,老龄后逐渐萎缩,因此胸腺原料必须采自后逐渐萎缩,因此胸腺原料必须采自幼龄动物。幼龄动物。3 3生物状态生物状态 动物饱食后宰杀,胰脏中的胰岛动物饱食后宰杀,胰脏中的胰岛素含量增加,对提取胰岛素有利,但素含量增加,对提取胰岛素有利,但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空,对胆胆囊收缩素的分泌使胆汁排空,对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫血汁的收集不利。严重再生障碍性贫血症患
19、者尿中的症患者尿中的EPOEPO(erythropoietin,erythropoietin,红细胞生成素)含量增加。红细胞生成素)含量增加。4 4原料来源原料来源 血管舒缓素可分别从血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪猪胰脏和猪颚下腺颚下腺中提取,两者生物学功能并无中提取,两者生物学功能并无二致,而稳定性以颚下腺来源为好,二致,而稳定性以颚下腺来源为好,因其不含蛋白水解酶。因其不含蛋白水解酶。一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段:对不同生物材料,要根据具体情况选择适当的分离提取方法。这一关系,可通过每一步骤的分析鉴定求出。3抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)(50)层析曲线细菌有
20、坚硬的细胞壁,首先要破碎细胞。纯化,即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、提取,即从原料中经溶剂分离有效成分,制成粗为了研究DNA分子在生命代谢中的作用,常常需要从不同的生物材料中提取DNA.DNA制品都可以用哪几种方法测定其含量?试从它们原理、准确性等方面加以比较。3分离后期的保护性措施细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎细胞。1molL三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.DNP在低浓度盐溶液中,几乎不溶解,如在0.一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为几个阶段?因此,在提取时,常用此法分离这两种核蛋白。每一个分离纯化步骤的好坏,除了从分辨能力和重现性两方面考虑外,还要注意方法本身的回收率,特别
21、是制备某些含量很少的物质时,回收率的高低十分重要。4其他保护措施(避免过酸过碱和剧烈搅拌)对每一步骤方法的优劣的记录,体现在所得产品重量及活性平衡关系上。动物的脏器组织,常用绞肉机机械法粉碎;如果某物质所具有的物理、化学等方面性质经过几种高灵敏度方法的鉴定都是均一的,那么大致可以认为它是均一的。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。5 5原料解剖学部位原料解剖学部位 猪胰脏中,胰尾部分含激素较多,而胰猪胰脏中,胰尾部分含激素较多,而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高各产品的收率。各产品的收率。胃膜素以采取全胃粘膜为好,胃蛋白酶胃膜素以采
22、取全胃粘膜为好,胃蛋白酶则以采取胃底部粘膜为好,因胃底部粘膜富则以采取胃底部粘膜为好,因胃底部粘膜富含消化酶。含消化酶。6.6.从简化提纯步骤着手从简化提纯步骤着手 如从鸽肝中提取乙酰化酶,需将如从鸽肝中提取乙酰化酶,需将动物饥饿后取材,可减少肝糖原,以动物饥饿后取材,可减少肝糖原,以简化纯化步骤。简化纯化步骤。7 7对生物技术产品宿主菌或细胞的要求对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。如用胞也应考虑到后处理的问题。如用大肠杆大肠杆菌菌表达,由于其不能将所表达的蛋白质分表达,由于其不能将所表达的蛋白质分泌到体
23、外,故提取时必须破壁,增加了提泌到体外,故提取时必须破壁,增加了提取的困难,而且还可能含有毒素类有害因取的困难,而且还可能含有毒素类有害因子;子;用用肿瘤细胞肿瘤细胞作宿主细胞制成的生化产作宿主细胞制成的生化产品还应考虑到其安全性,制造体外诊断用品还应考虑到其安全性,制造体外诊断用试剂则是很好的高产方法。试剂则是很好的高产方法。用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌,虽可解决这用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌,虽可解决这一矛盾,但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基一矛盾,但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷;用化等翻译及修饰的缺陷;用动物细胞和昆虫动物细胞和昆虫细胞细胞表达则能比较好地解决后处理及完整表
24、表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。达的问题。原料的粉碎原料的粉碎 在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适用的粒度,或将细胞破碎,使胞内生成适用的粒度,或将细胞破碎,使胞内生物活性物质充分释放到溶液中,有利于提物活性物质充分释放到溶液中,有利于提取或吸附。取或吸附。不同的生物体或同一生物体不同的组不同的生物体或同一生物体不同的组织,其破碎的难易不一样,使用的方法织,其破碎的难易不一样,使用的方法也不完全相同。动物的脏器组织,常用也不完全相同。动物的脏器组织,常用绞肉机机械法粉碎;植物肉质组织可以绞肉机机械法粉碎;植物肉质组织可以磨碎;许多微生物均具有坚韧的
25、细胞壁,磨碎;许多微生物均具有坚韧的细胞壁,常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波、加压处理等破碎方法。波、加压处理等破碎方法。如果提取的有效成分是体液或细菌胞如果提取的有效成分是体液或细菌胞外某些多肽激素、酶等,则不需要破碎外某些多肽激素、酶等,则不需要破碎细胞。细胞。主要通过机械力的作用,使组织粉主要通过机械力的作用,使组织粉碎。粉碎少量原料时,可使用高速组织碎。粉碎少量原料时,可使用高速组织捣碎机(捣碎机(10 000r10 000rminmin)、匀浆器、研)、匀浆器、研钵、研船等。工业生产上一般常用的粉钵、研船等。工业生产上一般常用的粉碎设备有电磨机、
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