生化工程下游技术课件第十二章色谱分离.ppt
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- 生化 工程 下游 技术 课件 第十二 色谱 分离
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1、第十二章色谱分离色谱分离又称层析分离 1)利用各组分物理化学性质的差别 2)使各组分不同程度的分布于流动和固定的两相中 3)造成各组分的移动速度产生差别 使各组分相互分离。特点:特点:(1 1)纯化倍数高纯化倍数高(2 2)操作规模小,放大困难操作规模小,放大困难(3 3)终产品纯化终产品纯化(4 4)适用于价格昂贵的产品适用于价格昂贵的产品 色谱分离包括一个流动相(气相或液相)和一个固定相,色谱分离包括一个流动相(气相或液相)和一个固定相,分离的基础是组分的分离的基础是组分的差速迁移差速迁移。在色谱柱中流动相沿固定相。在色谱柱中流动相沿固定相流动,混合物中各组分在此固定相与流动相间的分配不同
2、,流动,混合物中各组分在此固定相与流动相间的分配不同,在固定相中相对量多的组分,与固定相在一起的时间分率大,在固定相中相对量多的组分,与固定相在一起的时间分率大,随流动相一起流动的速度就慢。这样,由于混合物中各组分随流动相一起流动的速度就慢。这样,由于混合物中各组分被固定相滞留的程度不同,它们随流动相移动的速度就不同被固定相滞留的程度不同,它们随流动相移动的速度就不同(称为差速迁移),随流动相移动快的组分先离开色谱柱,(称为差速迁移),随流动相移动快的组分先离开色谱柱,随流动相移动慢的组分后离开色谱柱,因而可使混合物的各随流动相移动慢的组分后离开色谱柱,因而可使混合物的各组分互相分离。组分互相
3、分离。第一节 色谱分离的分类一、根据分离机理分类1、根据分离机理分类 吸附色谱 依靠对固体的吸附作用。分配色谱 依靠溶质在液液两相的溶解分配 离子交换色谱 依靠离子交换作用 位阻排斥色谱 依靠多孔固体或凝胶的排斥效应 亲和色谱 依靠生物分子的专一性结合 StationaryphaseMobilephaseOne Plate of SeparationLLLADSORPTION PARTITIONLiquid-SolidLiquid-LiquidABC(色层分析法的基本原理:非极性极性非极性极性两相系统样品分子依据分子极性选择性进入流动相或固定相样品样品样品凝胶过滤法:樣本樣本固固定定相相流流动
4、动相相小分子被延滯大分子流出較快小分子大分子Stokes radius分子大小、形狀凝胶过滤法的洗脱图谱:XYZVoVeAEnzyme activityVt0EVo 之前不應有物質溶離出來Vt 之後不應有物質溶離出來NaClEl ut i on Vol ume(mL)目標酵素(E)最好不要落在主要蛋白質峰(Y)的範圍內目标酶(E)最好不要落在主要蛋白质峰(Y)的范围内V0之前不应有物质洗脱出来Vt之后不应有物质洗脱出来载 体+样品分子流动相固定相阳离子基团Counterion阴离子+离子交換法 Anion Exchange 选择离子交換介質Buffer pH76891043+-0Net Cha
5、rge of a Prot ei npI陰離子交換陽離子交換5亲和层析法四項要素Sol i d M at ri xC oupl i ngR eact i onEl ut i onLi gand(A)Speci f i cBi ndi ngSubst ance(B)BA(3)(1)(2)(4)配 体雜 質溶 離耦合反應BBB耦合反应杂质洗脱 亲和层析法的作用机理:Sam pl eABBEl ut i onW ashi ng(1)(2)(3)BAA固相擔体親和基團 配體XX亲和基团配体固相载体Ni固相载体Metal Chelate Affinity ChromatographyHis HisHis
6、Protein 金属螯合层析法:2、按固定相形状不同分类 柱色谱 分离体系采用圆柱管 空柱色谱 色谱柱是空心无阻碍的中心通道形色谱 纸上色谱 固定相是滤纸或将固定相载于纸上 薄层色谱 固定相是一层吸附剂物料,平铺于惰性平板上 3、按流动相和固定相分类 气相色谱 流动相是气体 液相色谱 流动相是液体 超临界色谱 流动相是超临界流体4、按色谱操作分类 迎头或前沿色谱 以阶梯进料的形式操作 冲洗色谱 连续加入冲洗剂,脉冲进料 置换色谱 在前沿色谱的基础上,用吸附能力最强的组分置换 程序升温色谱 床层温度升高,吸附等温线的斜率减小,有规则的升高色谱柱的温度,有利于吸附力强的组分脱附 阶梯淋洗色谱 用不
7、同离子强度(如pH值或盐浓度等)的溶液有规律地冲洗床层,使性质接近的离子或组分得以分离。5、根据操作压力的不同分类 低压色谱 0.5MPa 中压色谱 0.5 5MPa 高压色谱 5 50MPa 第二节 生物工业中的色谱分离 一、色谱分离的规模 色谱分析:20g/d二、色谱分离方法的选择 选择不同的色谱分离方法的依据:1)目的产物的分子结构、物理化学特性及分子量的大小。2)主要杂质,特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相接近的杂质的成分与含量。3)目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。三、分析色谱与制备色谱和工业色谱的比较 1)应用色谱技术范围的不同 2)操作上的不同 3)色谱分离理论上
8、的不同 理论塔板数的不同 2 分配系数的不同 3 样品保留值与峰高的不同 第四节 色谱分离的基本原理在色谱操作中,加入洗脱剂而使各组分分层的操作称为洗脱时从柱中流出的溶液称为展开后各组分的分布情况称为一、分配色谱 是利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得以分离,其过程相当于连续性的溶剂抽提。(一)分配系数 在一定条件下,一定量的溶质在两种互不相溶的溶剂中达到平衡时,溶质在两种中的浓度之比为一常数,此常数称为(二)阻滞因数 溶质在色谱柱(纸、板)中的移动速率与流动相移动速率之比称为,以Rf表示,因而也称为Rf值。Rf=1,溶质不溶于固定相 Rf=0,溶质不溶于流动相 0Rf1
9、,Rf越大,溶质随流动相流动的速度越快(三)塔板理论 同化工原理中的蒸馏操作一样,色谱柱的分离效率也可用塔板理论来描述。二、吸附色谱 吸附现象是表面的一个重要性质之一。固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分于所受的吸引力不相等。表面层所受的作用力小,因而溶质分子在流动过程中碰到固体表面时受到表面剩余力的影响,被吸附而停留下来。吸附色谱可分为无机基质吸附色谱(多种作用力)、疏水作用吸附色谱(疏水作用)、共价作用吸附色谱(共价键)、金属整合作用吸附色谱(整合作用)、聚既胺吸附色谱(氢键作用)等。此外,离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱,(一)等温曲线 吸附等温曲线是指在一定温度下溶质分子在
10、两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。(二)解离常数与分离因数 在反应工程中,人们习惯于应用解离常数来讨论分子间的相互作用。三、凝胶色谱分离 凝胶色谱分离具有许多特点:(1)凝胶为不带电荷的惰性物质,不与溶质分子发生任何作用,因此分离条件温和,蛋白质收率高,重现性好;(2)、应用范围广,分离分子量的覆盖面大,可分离从几百到数百万分子量的分子;(3)设备简单,易于操作,周期短,层析剂不需再生即可反复使用,有的可连续使用几百次至上千次。这些优点使凝胶色谱分离已成为一种通用的分离方法,在生物大分子物质的制备与生产技术中被广泛应用。第五节 柱色谱分离法 工业规模的色谱分离大
11、多采用柱色谱分离法,而且吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子交换色谱和亲和色谱等都可在柱中进行,它们的实验装置和操作方法也基本类似。一、层析剂 用于色谱分离技术中的固定相或分离介质,总称为。它由和团(或活动中心)组成。其中,层析剂的基质材料应为化学惰性物质,与目的产物和杂质都无结合作用;活性官能团则根据所用色谱分离方法选用或者制取。生物产品所需固定相或层析剂应具有下列特性:(1)不溶于流动相,且具有较好的化学稳定性和机械强度;能经受使用、清洗和再生时的各种环境条件;对于生物活性物质的分离,还必须能耐受生物降解作用。(2)具有较大的表面积和孔隙度,且粒度、孔径分布均匀。(3)有较高的回收率和负载量
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