分子生物学平台上的食品微生物快速检测及鉴定技术课件.ppt

1、分子生物学平台上的食品微生物快速检测及鉴定技术在分子生物学技术上引领前行在分子生物学技术上引领前行21/17/202331/17/2023Life Technologies Profile美国生命技术公司营业收入$3.2B产品种类50,000国家160员工数量9,600客户数量75,000专利许可3,600Note:LTM revenue as of September 30,2009;does not include Mass Spec JV revenue4临临床床分子诊断基因治疗药物再生医学工工业业生物制药法医食品安全动物健康科研科研PCR技术测序技术细胞(分离,操作，分析)“Tools

2、 Provider”提供工具“Solutions Provider”提供解决方案Applied Biosystems 分子生物学技术的领导者分子生物学技术的领导者 超过超过2525年的分子生物学产品开发历程年的分子生物学产品开发历程 19821982年年,全球第一台蛋白质测序仪；全球第一台蛋白质测序仪；19861986年，全球第一台核酸测序仪年，全球第一台核酸测序仪 19861986年，全球第一个实时荧光定量技术和年，全球第一个实时荧光定量技术和TaqManTaqMan技术技术 全球全球30,000 30,000 个实验室的个实验室的220,000 220,000 仪器正在被使用仪器正在被使用

3、51/17/2023Life Technology 食品微生物系统解决方案样品前处理Dynabead磁珠富集MagMAX Express核酸自动提取快速检测RapidFinder常规qPCR检测超高通量的筛查OpenArray芯片芯片鉴定与分型MicroSEQ ID 基因分析灵活的组合方案，满足不同层次的应用需求61/17/2023病原微生物样品制备PrepSEQ PrepSEQ 快速离心核酸提取试剂盒快速离心核酸提取试剂盒 AB专利的离心柱材料 较化学法，更加有效去除PCR抑制剂 步骤少、操作简单 可处理多达750uL的样品 无需额外的设备适合少量适合少量样样品品采用采用PrepSEQPre

4、pSEQ快速离心试剂盒，结果明显优于普通直接裂解；尤其对于存在快速离心试剂盒，结果明显优于普通直接裂解；尤其对于存在PCRPCR抑制剂的样品，抑制剂的样品，普通裂解法可能无法检出，普通裂解法可能无法检出，而而PrepSEQPrepSEQ快速离心法可以得到一致的结果快速离心法可以得到一致的结果样品：巧克力检测项目：沙门氏菌样品：布里奶酪检测项目：李斯特菌*标注的是因PCR抑制剂的存在导致样品中待测菌无法检出71/17/2023SamplePCR compatibleNA solutionLysisMagnetic Particles+BindingSolutionWash2XMagneticSe

5、parationMagneticSeparationElutionMME-96 核酸提取核酸提取仪仪 自动化 高通量自自动动化的理想化的理想选择选择PrepSEQ 核酸提取核酸提取试剂试剂盒盒 提高核酸回收率 有效去除抑制剂 食品，环境及临床样品病原微生物样品制备+自自动动化的核酸提取流程，一次最多化的核酸提取流程，一次最多处处理理96个个样样品品81/17/2023样品制备软件 RapidFinder Express 软软件件PrepSEQ RapidSpin样样品制品制备备系系统统检测试剂MicroSEQ 食品致病菌食品致病菌检测试剂检测试剂盒盒仪器7500 快速快速实时荧实时荧光定量光定

6、量PCR仪仪器器PrepSEQ NA Extraction 样样品制品制备备系系统统食品致病菌检测解决方案食品致病菌检测解决方案91/17/2023食品及环境病原微生物检测致病菌系列致病菌系列沙门氏菌（AOAC certificated）单增李斯特菌（AOAC certificated）李斯特菌属（AOAC certificated）大肠杆菌O157:H7（AOAC certificated）阪崎肠杆菌空肠弯曲杆菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌弯曲杆菌多重检测：空肠/大肠/红嘴鸥金黄色葡萄球菌创伤、霍乱和副溶血性弧菌的多重检测定制设计环环境和生物安全系列境和生物安全系列军团菌属定量检测试剂盒嗜肺军

7、团菌定量检测试剂盒土拉弗朗西斯菌检测试剂盒炭疽芽孢杆菌检测试剂盒布鲁氏菌属检测试剂盒鼠疫耶尔森菌检测试剂盒101/17/2023最新O157:H7检测试剂盒：提升特异性 引物、探针设计：基于 SOLiD 测序技术分析结果 新的设计，针对O157:H7特有的序列，避免O55:H7被测出-双重目标基因设计，提高特异性-将O55 全基因组测序，并与 O157相比较ORFs(both strands)GC content per 1000 bpO157:H7(EDL933)reference sequenceO157:H7 SOLiDcoverageO55:H7 SOLiDcoverageO157:H

8、7 unique sequences111/17/2023 TaqMan 实验数据验证：包括低浓度的O157:H7/HM 不同菌株包括对非O157:H7的大肠杆菌菌株的检测不含O157的真实牛肉样品Strain IDSerotypeAssay CtPE30O157:H736.21+PE677O157:H731.16+PE678O157:H731.61+PE679O157:H733.97+PE700O157:H736.46+PE701O157:H733.7+PE702O157:H735.66+PE703O157:H736.57+PE40O157:NM31.4+PE674O55:H7Undeter

9、mined-PE704O55:H7Undetermined-PE705O55:H7Undetermined-PE706O55:H7Undetermined-PE31O26:H11Undetermined-PE37O145:NMUndetermined-PE38O78:K80:H12 Undetermined-PE39O103:H2Undetermined-PE673O5:NMUndetermined-PE684O137:H41Undetermined-PE687O18:H21Undetermined-PE688O28:H35Undetermined-PE731O26:H32Undetermin

10、ed-PE735O55:H9Undetermined-PE826O154:H25Undetermined-PE827O156:H8Undetermined-Beef(17 samples)n/aUndetermined-最新O157:H7检测试剂盒：提升特异性121/17/2023O157:H7检测试剂盒：8小时内获得结果6小时小时 BHI增菌增菌60分钟分钟 DNA 提取提取40分钟分钟PCR25g 牛肉手工操作手工操作时间时间 1小小时时10 分分钟钟10 分分钟钟整个流程整个流程 8小小时时MicroSEQ 大大肠肠杆菌杆菌 O157:H7 工作流程工作流程10分钟样品分钟样品制备设置制

11、备设置10 分分钟钟10分钟分钟 PCR 设置设置市市场场上最快的上最快的检测检测方法方法已已经获经获得得 AOAC 及及 AFNOR 的的认认可可131/17/2023MicroSEQ 沙门氏菌检测操作流程 快速获得结果，最少的手工操作时间 MLST片段分析片段分析 AFLP MLVA 微生物耐微生物耐药药机理的研究机理的研究SNaPshot MultiplexSSCP321/17/2023遗传分析仪在MLVA研究中的应用多重多重 PCRPCR 选择正确的扩增引物是取得成功的关选择正确的扩增引物是取得成功的关键键 16 16 个甚至更多的个甚至更多的 STR STR 位点同时被扩位点同时被扩

12、增增7 repeats8 repeatsSTR STR 位点位点 由特定引物延伸的旁侧序列具有保守由特定引物延伸的旁侧序列具有保守性性 不同菌株的串联重复序列拷贝数存在不同菌株的串联重复序列拷贝数存在差异差异AMELD3TH01TPOXPenta DPenta EFGAD21D18CSFD16D7D13D5VWAD8由遗传分析仪电泳分离由遗传分析仪电泳分离PCRPCR扩增产物扩增产物/片段片段 结合不同的荧光染料标记和迁移率的修饰结合不同的荧光染料标记和迁移率的修饰技术，实现多重分析技术，实现多重分析331/17/2023STEC O157/Salmonella Typhimurium Pro

13、tocolMLVA 是食源性微生物分型国际组织是食源性微生物分型国际组织Pulsenet推荐的食品微生物分型方法，推荐的食品微生物分型方法，中国中国CDC及各省级及各省级CDC均设立相关机构参与其中均设立相关机构参与其中.341/17/2023大肠杆菌7个位点的 MLVA，实现对O157:H7 的分型Lindstedt,et al.(2003)Ann.Clin.Microbiol.Antimicr.,2,12.Seven locus MLVA scheme in a single dye channelIdentified 47 distinct MLVA patterns among 73

14、O157:H7 strainsSequence alignment of the Vhec4 VNTR loci from isolates G5300 and IHE5344.The results from the sequencing show that the electrophoretic mobility shift between isolates IHE5344(upper strand)and G5300(lower strand)is caused by different numbers of AAATAG repeat units alone Escherichia c

15、oli O157 MLVA Fragment patterns generated from seven VNTR loci showing two identical and one different profile.Comparison of the MLVA profiles of three O157:H7 STEC cattle isolates.These isolates were all identical by previous XbaI PFGE and AFLP typing.The MLVA assay confirmed that isolates 126/97(u

16、pper panel)and 131/97(middlepanel)were identical,but displayed a clearly distinct profile for isolate 127/97(lower panel).351/17/2023Applied Biosystems 遗传分析仪在食品工业的应用 微生物快速鉴定微生物快速鉴定-技术技术:测序技术测序技术+数据库数据库-用途用途:食品污染检测及分析食品污染检测及分析转基因食品判定转基因食品判定-技术技术:测序技术测序技术-用途用途:准确鉴别、最终判定准确鉴别、最终判定 微生物菌株分型微生物菌株分型-技术技术:MLST/MLVA/AFLP-用途：污染源分析用途：污染源分析 遗传选遗传选育育-技技术术:AFLP-用途用途:优优良品种良品种选选育育真假物种鉴定真假物种鉴定-技术技术:测序技术，微卫星分析测序技术，微卫星分析-用途用途:掺假鉴别，掺假鉴别，名贵物种鉴别名贵物种鉴别品系品系/原产地原产地DNA标记标记-技术技术:SSR技术技术-用途用途:种子纯度分析种子纯度分析 原产地鉴别原产地鉴别品质提升品质提升+质量控制质量控制361/17/2023谢谢！