《单克隆抗体技术》课件.ppt

1、单克隆抗体技术单克隆抗体技术 疫苗和抗体的研制，是生物技术发展的永恒主题。目前在美国单克隆抗体类药物已占FDA所批生物药的3/4。美国已上市美国已上市16种单克隆抗体药物种单克隆抗体药物 2002年销售额年销售额 29亿美元亿美元 2005年年 90亿美元亿美元 我国的单克隆抗体药物市场还处于起我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段，更谈不上抗体组药物的发展。步阶段，更谈不上抗体组药物的发展。每個每個 抗原決定基抗原決定基 至少誘生一種至少誘生一種專一性抗体專一性抗体抗体体内生成的理论 抗原刺激前，机体具有抗体初级库 抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发生克隆性增殖。在抗原的反复刺激下，

2、抗体的V区发生高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行类别转换，最终抗体成熟。传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 234BALB/c12341 234杂交瘤技术的理论基础 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb癌细胞可培养生长浆细胞B cell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组两组染色体混在一起染色体混在一起也可以培也可以培养养生長生長产产生生专专一性抗一性抗体体一個個 B

3、 cell 只只产生一产生一种抗种抗体体细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸谷 氨 酰 胺 （A-）尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）mm核酸HAT选择培养基的原理 HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞）（B细胞恶性肿瘤）1.抗体分泌（Ig+)1.具永生性 2.HGPRT+在HAT生长 2.8-AG筛选出 HGPRT-株 PEG 融合 HAT筛选 脾

4、-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（HGPRT+、Ig+）融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次）获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）McAb 纯化及鉴定 制备单克隆抗体的基本技术1 抗原提纯与动物免疫2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合4 抗体检测5 杂交瘤的克隆化和冻存6 McAB的制备7 单克隆抗体的纯化 抗体X-a-b-c-d-a -b -c

5、 -d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和 脾脏产生各种 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫 抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集 B 細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次Ag X 免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 可溶性

6、抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。1234mmmm12341234单单抗抗细胞融合细胞融合取出脾細胞取出脾細胞+癌細胞癌細胞各抗各抗体体分分开开 骨髓瘤细胞系选择要点：稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 等。保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎

7、牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 饲养细胞一般在融合前一天制备 免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。融合比例：骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10 融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgXELISAHATPEG Cell fusionHy

8、bridoma cells 融合瘤细胞（Subcloning）(确定只有一种细胞)ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d新的抗原 一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染 一一个个 B 细胞只能生细胞只能生产产一一种种抗体，抗体，对对付某一付某一 抗原決定基。抗原決定基。BBBYYYY抗 原BYB11Y22Y33Y441234mmmm1234YYYYYYYYY 单抗生产的方法：动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。基因工程抗体 (3)单域抗体(4)最小识别单位