陈继峰《生物技术制药》天然抗癌药物紫杉醇专题2课件.ppt

1、天然抗癌药物紫杉醇的生产专题专题2 2 目录目录1、紫杉醇简介、紫杉醇简介2、紫杉醇的作用紫杉醇的作用3、南方红豆杉组织培养南方红豆杉组织培养4、紫杉醇的产量紫杉醇的产量 5、小结、小结1、紫杉醇简介、紫杉醇简介v1963年美国化学家瓦尼（年美国化学家瓦尼（M.C.Wani）和沃尔）和沃尔（Monre E.Wall）首次从一种生长在美国西部）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，中，Wani和和 Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养发现紫杉醇粗提

2、物对离体培养的的鼠肿瘤细胞有很高活性鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活并开始分离这种活性成份。性成份。v野生红豆杉一般散生在海拔野生红豆杉一般散生在海拔1500-3000m的深山密的深山密林中，紫杉醇是从红豆杉树皮中提取出来的，林中，紫杉醇是从红豆杉树皮中提取出来的，每每生产生产1kg紫杉醇需红豆杉树皮紫杉醇需红豆杉树皮30吨吨，而且必须以成，而且必须以成年树木为原料，因此，紫杉醇售价昂贵，国际市年树木为原料，因此，紫杉醇售价昂贵，国际市场上每公斤售价在场上每公斤售价在40万美元以上，最高时曾达到万美元以上，最高时曾达到2200万美元万美元/公斤。公斤。红豆杉红豆杉v紫杉醇是从红豆杉（又名

3、紫杉）树皮中分离的一紫杉醇是从红豆杉（又名紫杉）树皮中分离的一种二萜类化合物，种二萜类化合物，具有天然的抗癌功效具有天然的抗癌功效，能有效，能有效治疗卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、恶性黑治疗卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、恶性黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤以及类风湿性色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤以及类风湿性关节炎也有一定作用，关节炎也有一定作用，被认为是人类同癌症抗争被认为是人类同癌症抗争的最有利武器的最有利武器，于，于1992年被美国食品和药物管理年被美国食品和药物管理局局(FDA)正式批准为抗癌新药。正式批准为抗癌新药。2、紫杉醇的作用、紫杉醇的作用v 目前，虽然关于紫杉醇的研究取得

4、了很大的进展，但仍没有比较成型目前，虽然关于紫杉醇的研究取得了很大的进展，但仍没有比较成型的可进行工业化生产的技术。的可进行工业化生产的技术。v问题：问题：v 提取紫杉醇的红豆杉资源不足提取紫杉醇的红豆杉资源不足v 化学结构复杂，难以用化学合成法进行工业化生产化学结构复杂，难以用化学合成法进行工业化生产v 细胞培养法因周期太长，难以实现工业化生产细胞培养法因周期太长，难以实现工业化生产v 真菌发酵法生产的产量远远低于植物细胞的产量真菌发酵法生产的产量远远低于植物细胞的产量v 但是，从长远来看但是，从长远来看,紫杉细胞培养才是解决紫杉醇供需矛盾的最佳途紫杉细胞培养才是解决紫杉醇供需矛盾的最佳途径

5、。因此径。因此,紫杉细胞培养的研究近年来十分活跃。紫杉细胞培养的研究近年来十分活跃。3 3、南方红豆杉组织培养、南方红豆杉组织培养v（1）、南方红豆杉外植体的预处理）、南方红豆杉外植体的预处理v以当年生的茎段为材料，用清水冲洗干净，转入以当年生的茎段为材料，用清水冲洗干净，转入70%酒精浸泡酒精浸泡30s，用无菌水漂洗一次，再转入，用无菌水漂洗一次，再转入0.2%的升汞中浸泡的升汞中浸泡8min。再经无菌水冲洗。再经无菌水冲洗5次，次，每次每次1-2min，用无菌滤纸吸去水分。，用无菌滤纸吸去水分。v（2）、愈伤组织的诱导）、愈伤组织的诱导v将处理好的茎段切成将处理好的茎段切成1cm的小段，接

6、种于附加了的小段，接种于附加了0.15mg/L的萘乙酸的萘乙酸(NAA)、0.1mg/L的的6-苄氨基嘌苄氨基嘌呤呤(6-BA)、0.25mg/L的的2，4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸(2,4-D)的的MS培养基上，放入人工气候箱，培养基上，放入人工气候箱，24下暗培养，下暗培养，相对湿度相对湿度60%。v红豆杉愈伤组织的诱导，必须有植物生长调节物红豆杉愈伤组织的诱导，必须有植物生长调节物质的参与，且对植物生长调节物质的种类和配比质的参与，且对植物生长调节物质的种类和配比有严格的要求，其中有严格的要求，其中NAA和和6-BA的浓度对愈伤的浓度对愈伤组织的诱导和生长速度均有非常重要的影响，组织的诱

7、导和生长速度均有非常重要的影响，2，4-D也有一定的作用。也有一定的作用。v（3）、愈伤组织的传代培养）、愈伤组织的传代培养v在在MS培养基上，愈伤组织的诱导率较高，但是该培养基上，愈伤组织的诱导率较高，但是该培养基却不适合红豆杉愈伤组织的生长，因此，培养基却不适合红豆杉愈伤组织的生长，因此，我们选用我们选用B5培养基作为红豆杉愈伤组织的生长培培养基作为红豆杉愈伤组织的生长培养基。养基。v愈伤组织诱导率愈伤组织诱导率=愈伤组织数愈伤组织数/外植体数外植体数v挑选出质地疏松、颜色浅绿或者白色的红挑选出质地疏松、颜色浅绿或者白色的红豆杉愈伤组织接种于附加了豆杉愈伤组织接种于附加了0.5mg/L的的

8、NAA、0.5mg/L的的6-BA和和1.0g/L的水解酪的水解酪蛋白的蛋白的B5培养基，培养基，24下黑暗培养，每下黑暗培养，每35天继代一次。天继代一次。v紫杉醇是红豆杉的一种次生代谢产物。紫杉醇是红豆杉的一种次生代谢产物。水水解酪蛋白作为诱导子加入培养基中解酪蛋白作为诱导子加入培养基中，起着，起着刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的作用。它可以通过改变次生代谢途径中催作用。它可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力，引起次生代谢途径中代谢化酶的酶活力，引起次生代谢途径中代谢通量和反应速率的改变，从而提高次生代通量和反应速率的改变，从而提高次生代谢产物的

9、产量。谢产物的产量。v不用不用2,4-D作为生长素的主要原因是，它作为生长素的主要原因是，它对红豆杉的对红豆杉的次生代谢有抑制作用次生代谢有抑制作用，影响紫，影响紫杉醇的产量。而且杉醇的产量。而且2,4-D是一种是一种潜在的致潜在的致癌物质癌物质，应尽量减少其在植物细胞内的积，应尽量减少其在植物细胞内的积累。累。（4 4）、愈伤组织的抗褐变）、愈伤组织的抗褐变v褐变现象：植物组织在破损时会溢出一些酚类物褐变现象：植物组织在破损时会溢出一些酚类物质，可被酶类或空气中的氧气催化氧化成有毒的质，可被酶类或空气中的氧气催化氧化成有毒的醌类物质，使得愈伤组织出现褐色乃至黑色，导醌类物质，使得愈伤组织出现

10、褐色乃至黑色，导致细胞死亡，这就是褐变现象。致细胞死亡，这就是褐变现象。愈伤组织褐变程度可分愈伤组织褐变程度可分5级：级：0级：外观鲜艳，黄白级：外观鲜艳，黄白色；色；1级：轻度褐变，基本上黄白色；级：轻度褐变，基本上黄白色；2级；褐变，级；褐变，黄褐色；黄褐色；3级：较严重褐变，褐色；级：较严重褐变，褐色；4级：严重褐级：严重褐变，黑褐色。变，黑褐色。v褐变的机制：褐变的机制：褐变包括酶促褐变和非酶促褐变。褐变包括酶促褐变和非酶促褐变。目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促引目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促引起的。酶促褐变必须具有酶、底物和氧起的。酶促褐变必须具有酶、底物和氧3个条

11、件。个条件。引起褐变的酶有多酚氧化酶（引起褐变的酶有多酚氧化酶（PPO）、过氧化物）、过氧化物酶（酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等，但最）等，但最主要的是主要的是PPO，它使植物组织细胞中含有的酚类，它使植物组织细胞中含有的酚类物质氧化成棕褐色醌类，从而产生酶促褐变。物质氧化成棕褐色醌类，从而产生酶促褐变。v褐变与材料的基因型和生理状态、培养基成分和褐变与材料的基因型和生理状态、培养基成分和激素配比等因素有关。激素配比等因素有关。要防止褐变发生，减轻褐要防止褐变发生，减轻褐变危害，除了要选择合适的外植体、培养基和适变危害，除了要选择合适的外植体、培养基和适宜的激素组

12、合外，添加抗褐变剂是较为方便有效宜的激素组合外，添加抗褐变剂是较为方便有效的常规手段。目前常用的抗褐变剂有的常规手段。目前常用的抗褐变剂有EDTA、植、植酸（酸（PA）、水解酪蛋白、硫代硫酸钠、活性炭）、水解酪蛋白、硫代硫酸钠、活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗坏血酸）、抗坏血酸（Vc）等。）等。v红豆杉愈伤组织的褐变主要是在多酚氧化红豆杉愈伤组织的褐变主要是在多酚氧化酶（酶（PPO）的催化下发生的，）的催化下发生的，PPO是一种是一种含铜离子的酶，上述抗褐变剂中含铜离子的酶，上述抗褐变剂中PA能够络能够络合铜离子，水解酪蛋白可以与酶底物竞争合铜离子，水解酪蛋白可

13、以与酶底物竞争性结合，而性结合，而AC可以对酶进行吸附。可以对酶进行吸附。褐变的机制褐变的机制4 4、紫杉醇的产量、紫杉醇的产量v（1）、标准曲线的绘制）、标准曲线的绘制v精确称取紫杉醇标准品精确称取紫杉醇标准品2.4mg溶于甲醇中定容至溶于甲醇中定容至50mL，以甲醇为对照，在紫外分光光度计上进行，以甲醇为对照，在紫外分光光度计上进行全波段扫描以确定最大吸收峰。再将标准品的甲全波段扫描以确定最大吸收峰。再将标准品的甲醇溶液稀释成浓度梯度为醇溶液稀释成浓度梯度为48、24、12、6、3、1.5g/mL的溶液，在其特征吸收波长下测定吸光的溶液，在其特征吸收波长下测定吸光度度A值，绘制紫杉醇标准品

14、的值，绘制紫杉醇标准品的UV标准曲线。标准曲线。v（2）、紫杉醇的提取）、紫杉醇的提取v称取称取2.0g传至第三代的南方红豆杉愈伤组织，经蒸溜水洗传至第三代的南方红豆杉愈伤组织，经蒸溜水洗去琼脂后用滤纸吸去愈伤组织表面的水分。把愈伤组织置去琼脂后用滤纸吸去愈伤组织表面的水分。把愈伤组织置于研钵中，加入于研钵中，加入CH3COOC2H5/C2H5OH（V:V=1:1）20.0mL进行匀浆。所得提取液进行匀浆。所得提取液3000r/min离心离心5min，收集，收集上清液，常温下减压除去溶剂，所得浸膏加入上清液，常温下减压除去溶剂，所得浸膏加入10.0mL水，水，用氯仿用氯仿10.0mL萃取浸膏，

15、共萃取浸膏，共3次，氯仿萃取液合并共约次，氯仿萃取液合并共约30.0mL。向其中加入。向其中加入6.0mL丙酮，再次常温减压蒸干，用丙酮，再次常温减压蒸干，用甲醇甲醇10.0mL定容，用紫外分光光度计测定吸光度，并计算定容，用紫外分光光度计测定吸光度，并计算紫杉醇含量。紫杉醇含量。v将南方红豆杉树皮样品风干后粉碎，将南方红豆杉树皮样品风干后粉碎，40下烘干下烘干24h。称。称取取20.0g粉末，置于研钵中，加入粉末，置于研钵中，加入CH3COOC2H5/C2H5OH（V:V=1:1）200.0mL，进行匀浆。所得提取液，进行匀浆。所得提取液3000r/min离心离心5min，收集上清液，常温下

16、减压除去溶剂，所得浸，收集上清液，常温下减压除去溶剂，所得浸膏加入膏加入100.0mL水，用氯仿水，用氯仿100.0mL萃取浸膏，共萃取浸膏，共3次，次，氯仿萃取液合并共约氯仿萃取液合并共约300.0mL。向其中加入。向其中加入60.0mL丙酮，丙酮，再次常温减压蒸干，用甲醇再次常温减压蒸干，用甲醇100.0mL定容，用紫外分光光定容，用紫外分光光度计测定吸光度，并计算紫杉醇含量。度计测定吸光度，并计算紫杉醇含量。紫杉醇标准品在紫杉醇标准品在208nm和和227nm处有特征吸收峰，本实验选择处有特征吸收峰，本实验选择227nm作为测定波长。作为测定波长。v树皮和愈伤组织的提取物在树皮和愈伤组织

17、的提取物在227nm下吸光度下吸光度A分别为分别为0.8285和和0.2379，代入回归方程，可，代入回归方程，可知其浓度分别为知其浓度分别为22g/mL和和5.41g/mL，相，相应的含量分别为应的含量分别为0.011%和和0.052%，通过组，通过组织培养紫杉醇的含量提高了织培养紫杉醇的含量提高了4.73倍。倍。5 5、小结、小结v由于近年来对紫杉醇的研究十分活跃，紫杉醇的由于近年来对紫杉醇的研究十分活跃，紫杉醇的获得方法也越来越多，紫杉醇的价格受到一定的获得方法也越来越多，紫杉醇的价格受到一定的影响，但是其利润依然惊人。据影响，但是其利润依然惊人。据2005年的数据说，年的数据说，全世界的需求为：全世界的需求为：4800-7200kg，但是全球产量仅，但是全球产量仅为为750kg。无论我们如何假设紫杉醇产量的增长，。无论我们如何假设紫杉醇产量的增长，紫杉醇供给远小于需求的局面仍没有改变。紫杉醇供给远小于需求的局面仍没有改变。