第4部分分子生物学诊断技术进展课件.ppt

1、1分子生物学诊断技术进展分子生物学诊断技术进展张张 正正北京大学人民医院北京大学人民医院2主要内容：主要内容：l分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用l简单介绍实验原理简单介绍实验原理l以以PCR、荧光实时定量、荧光实时定量PCR、NASBA为例为例l分子诊断技术在以下病原研究的应用进展分子诊断技术在以下病原研究的应用进展l乙型肝炎乙型肝炎l丙型肝炎丙型肝炎l结核分枝杆菌结核分枝杆菌3病原学检测常用的实验室技术病原学检测常用的实验室技术l细胞培养与鉴定（细胞培养与鉴定（“金标准金标准”）、动物实验）、动物实验l血清学、免疫学诊断技术血清学、免疫学诊断技术l

2、电镜技术电镜技术4分子生物学诊断技术方法简介分子生物学诊断技术方法简介1、主体技术、主体技术具体方法举例具体方法举例 循环扩增循环扩增PCR（聚合酶链反应）（聚合酶链反应）Real-time PCR,RT-PCR，巢式PCR，复合PCR PCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法LCR（连接酶链反应）（连接酶链反应）恒温恒温NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA）SDA（链置换扩增术）（链置换扩增术）CPT（环状探针技术（环状探针技术）bDNA（枝链核酸信号放大系统（枝链核酸信号放大系统）杂交捕获杂交捕获（如：检测（如：检测HPV-DNA的试剂盒）的试

3、剂盒）5分子诊断技术方法简介2、多标靶同时检测、多标靶同时检测l多重多重PCRl毛细管电泳毛细管电泳l以测序分析为基础的检测技术以测序分析为基础的检测技术6分子诊断技术方法简介3、核酸杂交、核酸杂交lDNA荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）l将标记的探针直接原位杂交到染色体或将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测检测DNA序列在染色体或序列在染色体或DNA纤维上的定位。纤维上的定位。l线性探针分析法（线性探针分析法（LiPA）l杂交保护分析法（杂交保护分

4、析法（HPA）4、质谱、质谱l利用色、质谱结合利用色、质谱结合PCR技术技术7分子诊断的功能及扩展分子诊断的功能及扩展l病原的诊断和鉴别诊断病原的诊断和鉴别诊断l病原分型病原分型l病毒载量监测病毒载量监测-个体化治疗的依据个体化治疗的依据l疗效及预后标志疗效及预后标志l其他：病原感染中发生、发展各阶段其他：病原感染中发生、发展各阶段8分子诊断的功能及扩展l疾病分型及意义疾病分型及意义例如：例如：HPV（30/100）高危高危-16，18，31，45 低危低危-6，119分子诊断的功能及扩展l病毒载量与治疗病毒载量与治疗 例例1.-北京地坛医院谢尧提供10分子诊断的功能及扩展l病毒载量与治疗病毒

5、载量与治疗例例2.HBV-干扰素干扰素HBV100pg/mL 1/30 阴转阴转(HBeAg HBeAb)11分子诊断的功能及扩展l病毒载量与治疗病毒载量与治疗例例3.HIV病毒载量与传播病毒载量与传播15127人人 流行病学调查流行病学调查415对伴侣对伴侣30个月个月HIV阳转阳转22%（90/415）51人人RNA1500copies/mL 全阴全阴12分子诊断的功能及扩展l病毒载量与治疗病毒载量与治疗例例4.血浆血浆EBV载量与鼻咽癌复发载量与鼻咽癌复发15个二年持续缓解：个二年持续缓解：0 copy/mL10个复发：个复发：32250 copies/mL17个随访：临床恶化前半年病毒

6、载量升高个随访：临床恶化前半年病毒载量升高13耐药病原的分子诊断耐药病原的分子诊断lWHO：人类死亡：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用是长期用药的毒副作用lHBV的的YMDD变异变异lHIV耐药耐药14血制品筛查血制品筛查l300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：余万的血清阴性样品，分子生物学复测：HBV：47HCV：10HIV-1：2 -2001年剑桥资料年剑桥资料 lHIV-1血清阴性而血清阴性而RNA阳性阳性 0.2-6.6%-Am.J.Chin Athol.200015l 在基础研究领域中的应用；在基础研究领域中的应用；l 遗传病的基因诊断和产前基因诊断：遗传病的基因诊断和产前基因

7、诊断：如血友病、地中海贫血等如血友病、地中海贫血等l 肿瘤基因和肿瘤标志物表达肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)(mRNA)的检测；的检测；l 骨髓移植、器官移植供体配型选择；骨髓移植、器官移植供体配型选择；l 法医学、动植物学、古人类学、古生物学；法医学、动植物学、古人类学、古生物学；l 与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；素、受体）的基因表达的检测；l 药物基因组学、耐药基因的检测，等等药物基因组学、耐药基因的检测，等等分子生物学技术在其它领域的应用分子生物学技术在其它领域的应用16简单介绍实验原理简单介绍实验原理lPC

8、R(Polymerase Chain Reaction,(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应聚合酶链反应)l荧光实时定量荧光实时定量PCR（real time PCR）lNASBA（依赖核酸序列的扩增）（依赖核酸序列的扩增）17PCRPCR原理原理:实质就是实质就是体外基因体外基因复制复制技术技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA聚合酶聚合酶 AmpErasePrimer靶序列靶序列加热变性加热变性95 C靶序列引物退火靶序列引物退火55 C引物延伸引物延伸72 C18PCR PCR 循环循环 第一步第一步 加热变性加热变性靶序列靶序列从外周血

9、白细胞或绒毛、羊水细胞提取的从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNADNA约约1ug1ug，在含有，在含有适当缓冲液、引物、适当缓冲液、引物、dNTPsdNTPs（dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP及及dTTPdTTP）等的）等的反应混合物中，在反应混合物中，在9494下热变性下热变性1-41-4分钟，使之解为单链。分钟，使之解为单链。19PCR PCR 循环循环第二步第二步引物与靶序列退火引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533引物与解为单链的引物与解为单链的DNADNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。上互补序

10、列杂交在一起，称之为退火。5555左右左右20PCR PCR 循环循环 第三步第三步 -引物延伸引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase在在DNADNA聚合酶催化作用下，以聚合酶催化作用下，以dNTPsdNTPs为原料（底物），从引物的为原料（底物），从引物的33端端A A开开始始,沿着沿着5353的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。7272左左右右21第1个PCR循环完成后靶序列 靶序列BiotinBiotin223030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶

11、序列扩增的数量No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Amplicon2353RQ探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，所以检测不到荧光，此种现象称为所以检测不到荧光，此种

12、现象称为荧光共振能量转移。荧光共振能量转移。荧光荧光PCRPCR原理原理 TaqManTM技术技术24535353RQExtension Step531.Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52.Cleavage3.PolymerizationComplete53QTaqR354.Detection533QTaqR5lR荧光荧光PCRPCR原理原理 TaqManTM技术技术25l定量定量PCR测定的是扩测定的是扩增的指数扩增期增的指数扩增期;l定性定性PCR测定的是扩测定的是扩增的终点（平台期）增的终点（平台期）定量定量PCRPCR与定性与定性PCRPCR测定的

13、区别测定的区别26市场上常见的实时荧光市场上常见的实时荧光PCR仪仪罗氏LightcyclerMJ opticon2伯乐icyclerABI7000杭州博日（原大和）linegene27临床标本临床标本核酸提取技术核酸提取技术NASBA 扩增扩增ECL-化学发光标记检测化学发光标记检测NASBA 扩增扩增+分子灯塔检测分子灯塔检测扩增过程中扩增过程中“分子灯塔分子灯塔”即即时同相检测时同相检测方法方法 1-NucliSens ECL方法方法 2-NucliSens EasyQ加入裂解缓冲液和内置标准加入裂解缓冲液和内置标准NASBA测定原理28NASBA扩增原理引物引物 1逆转录酶逆转录酶RN

14、ase H引物引物 2逆转录酶逆转录酶T7 RNA 聚合聚合 酶酶引物引物 2逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶RNase H引物引物 1线性循环线性循环扩增循环扩增循环29NASBA 和 PCR 的不同NASBANASBAv 扩增目标为扩增目标为RNAv 同温扩增同温扩增v 连续扩增连续扩增v 扩增物为单链扩增物为单链RNAv 引物次序不包含於最终产物中引物次序不包含於最终产物中PCRv 扩增目标为扩增目标为DNAv 温度循环扩增温度循环扩增v 循环扩增循环扩增v 扩增物为双链扩增物为双链DNAv 引物次序包含於最终产物中引物次序包含於最终产物中30乙型肝炎检测标志物：乙型肝炎检测标志物：lH

15、BsAg，抗-HBs,lHBeAg，抗-Hbe,l抗HBc (IgG,IgM),lHBV-DNADane颗粒（完整的病毒）形态颗粒（完整的病毒）形态乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断31乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断1.重要性重要性l全球全球 20亿人感染亿人感染l慢性慢性 3.5亿人亿人l中国、东南亚、非洲中国、东南亚、非洲50肝硬化，肝硬化，70-90肝癌肝癌l7-30携带者感染变异体携带者感染变异体322.HBV基因型与血清型关系及流行病学分布基因型与血清型关系及流行病学分布l基因型与血清型不完全一致基因型与血清型不完全一致l临床突变率不同临床突变率不同l有地域分布特点有地域分布

16、特点乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断33表1：基基因因型型血清学亚型血清学亚型基因长基因长度度(nt)临床突变率临床突变率主要主要流行地域流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Aadw2ayw132216.5（少）（少）C185845（常）（常）西欧、北欧、西欧、北欧、北美、中非、北美、中非、印度印度Badw2ayw1321550（常）（常）T185816东南亚、中国、东南亚、中国、日本日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550（常）（常）T1858或或C185858（常）（常）东南亚、中国、东南亚、中国、日本、澳洲、日本、澳洲、美国美国Day

17、w2;ayw3;ayw4318243%(常）常）T185812（低）（低）地中海、俄罗地中海、俄罗斯、印度、美斯、印度、美国国34表1(续）:基基因因型型血清学亚型血清学亚型基因基因长度长度(nt)临床突变率临床突变率主要主要流行地域流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Eayw4321227（中）（中）7（低）（低）西非西非Fayw4;adw2;Adw4q-321516（少）（少）C1858未定未定中美、南美、中美、南美、波利尼西亚波利尼西亚GAdw23248100（高）（高）未定未定中美、美国、中美、美国、法国、德国法国、德国Hadw43215未定未定未定未定中美、南

18、美、中美、南美、美国美国PC*:前核心前核心 BCP*:基本核心启动子基本核心启动子 （科华生物（科华生物 2004.07.21）353.基因型与临床基因型与临床l实验室表现不同（表实验室表现不同（表2）l病情与转归：病情与转归：C较较B差差l抗病毒治疗：抗病毒治疗：A优于优于D B优于优于C adw/ayw 20:1乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断36表2:B基因基因C基因基因HBeAg(+)少少多多免疫清除期免疫清除期短短长长严重急性加剧严重急性加剧少少多多组织学活动性组织学活动性低低高高血清血清HBV-DNA水平水平低低高高PC1896突变率突变率高高低低BCP双突变率双突变率低低高

19、高抗病毒治疗应答抗病毒治疗应答好好差差临床转归（硬化、癌变）临床转归（硬化、癌变）好好差差374.一般实验室分型方法一般实验室分型方法l测序测序lPCR-RELP（限制性片断长度多态性）（限制性片断长度多态性）lPCRl核酸杂交（谱线探针法）核酸杂交（谱线探针法）l血清学：单抗可区分血清学：单抗可区分A-F各基因型各基因型乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断385.抗病毒治疗的耐药性问题抗病毒治疗的耐药性问题l拉米夫定耐药性的检测乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断39拉米夫定耐药性的检测拉米夫定耐药性的检测l 耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸变异有关l I型：YMDD变异为

20、HBV聚合酶基因(P区基因)区第741个核苷酸位,A-G置换，使第552个密码子蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)取代，成为YVDD变异l II型：YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G-T置换，使第55个密码子蛋氨酸(M)被异亮氨酸(工)取代，成为YIDD变异 YMDD变异：Y（酪氨酸）M（蛋氨酸）V（缬）：YVDD变异 D（天冬氨酸）I（异亮）：YIDD变异 D（天冬氨酸）最近报道：YSDD（ATG AGT）l 应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断40乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断41乙型肝炎的分子诊断乙型肝炎的分子诊断42HCV的基因型/亚型6 6

21、个型，个型，6868个亚型个亚型 l1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,ml2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,ml3a,b,c,d,e,f,g,h,i,kl4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,tl5al6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n丙型肝炎的分子诊断丙型肝炎的分子诊断43HCV基因分型方法测序型特异性引物PCR分型法 线性探针杂交（InnoLipa)限制性片段长度多态性分析（RFLP）TRUGENE HCV 5NC Genotyping Assay丙型肝炎的分子诊断丙型肝炎的分子诊断445UTR(5Non-Coding

22、Region)高度保守高度保守HCV RNA诊断实验的常用区域诊断实验的常用区域有一套良好的多态性特征，因此可用于基因有一套良好的多态性特征，因此可用于基因分型分型 许多许多HCV分型商业试剂盒都采用该区进行分分型商业试剂盒都采用该区进行分型型TRUGENE HCV 5NC Genotyping AssayVERSANT HCV Genotyping Assay(LiPA)HCV NS5B区区各亚型间基因差异较大各亚型间基因差异较大扩增效率较低扩增效率较低若成功扩增，序列分析可区别若成功扩增，序列分析可区别HCV各亚型。各亚型。HCV基因分型常选用的区域基因分型常选用的区域丙型肝炎的分子诊断丙

23、型肝炎的分子诊断45临床工作l目前常用的基因型检测方法（目前常用的基因型检测方法（RFLP,InnoLipa,Trugene)通常建立通常建立在在5非编码区，因为该区序列保守，检测灵敏度高，是非编码区，因为该区序列保守，检测灵敏度高，是HCV RNA诊诊断实验的常用区域。断实验的常用区域。l在临床工作中，对在临床工作中，对5UTR进行分型的进行分型的RFLP,InnoLipa,Trugene分分型都可以满足分型的需要，为制定治疗方案和判断预后提供指导。型都可以满足分型的需要，为制定治疗方案和判断预后提供指导。l常只需将常只需将1 1型和型和4 4型与其它基因型相区别，以决定抗病毒治疗的疗程型与

24、其它基因型相区别，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量，因此上述的任何一种方法均可以采用。和利巴韦林的剂量，因此上述的任何一种方法均可以采用。丙型肝炎的分子诊断丙型肝炎的分子诊断46HCV 5UTR geneSecond PCR product=257bpScheme ACleavage with BsrB,Hinfand Hae93 and 91bp Genotype 2a and 2b257bpGenotype 3b,4a and 5a127 and 91bp104,74bp 160,74bp2a2b160,74bp234bp3b4a and 5aCleavage with HaeSch

25、eme C Cleavage with Apo183,74bp257bp4a1b197bpGenotype 1a,1b and 6a166/169 and 91bp Cleavage with BstUScheme B 1a227bp5aGenotype3a6a257bp HCV 5非编码区非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图程序复合酶切分型法流程图-北京大学人民医院肝病研究所提供47l抗抗HCV的确认实验的确认实验l确认的重要性（灰区的遗漏）确认的重要性（灰区的遗漏）目的：解决血液筛查实验（如目的：解决血液筛查实验（如ELISA）的非特异性问题）的非特异性问题方法：方法：例如：例如：PCR

26、 活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法 RIBA 3.0 抗体的确认抗体的确认l新流程：新流程：丙型肝炎的分子诊断丙型肝炎的分子诊断48 抗抗-HCV筛查检测筛查检测报告报告阴性阴性或或根据根据S/Co比值判定为阳性比值判定为阳性所有阳性结果所有阳性结果高高S/Co比值阳性比值阳性*报告报告低低S/Co比值阳性比值阳性*RIBA HCV检测检测或或阳阳性性报告报告阴阴性性报告报告不不确确定定报告报告阳性阳性阴阴性性RIBA HCV检测检测HCV RNA的的NAT检测检测阳阳性性报告报告阴阴性性报告报告不不确确定定报告报告报告报告*以S/Co 3.8(

27、OCD HCV ELISA 3.0)或 8.0(OCD VITROS ECi/ECiQ HCV)为“界值”。CDCCDC抗抗-HCV-HCV实验室检测结果报告导则实验室检测结果报告导则49靶序列来源靶序列来源:a.单抗检出的单抗检出的TB抗原蛋白编码基因抗原蛋白编码基因b.TB特异性核酸片段克隆特异性核酸片段克隆c.插插入序列入序列结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)的分子诊断的分子诊断TB 检测检测实验设计特点实验设计特点5065KD，165bp;MPB64，240bp;IS6110，123bp;IS986，245bp;16sDNA，584bp.举例举例结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

28、的分子诊断TB 检测检测51 标本处理标本处理：痰液化，抑制物去除：痰液化，抑制物去除 试剂质控及灵敏度试剂质控及灵敏度注意事项注意事项结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)的分子诊断的分子诊断TB 检测检测52 结核的结核的PCR临床主要应用临床主要应用 a.结核与其他分枝杆菌区分结核与其他分枝杆菌区分 b.结核耐药基因结核耐药基因 c.对含菌量低的标本的分离对含菌量低的标本的分离 d.为临床可疑者捕捉信息为临床可疑者捕捉信息临床评价临床评价结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)的分子诊断的分子诊断TB 检测检测53 PCR方法与痰涂片及方法与痰涂片及TB培养的比较培养的比较 应做比对研究应做比对研究临

29、床评价临床评价结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)的分子诊断的分子诊断TB 检测检测54lRFP（利福平）（利福平）lINH（异烟肼）（异烟肼）lSM（链霉素）（链霉素）lEMB（乙胺丁醇）（乙胺丁醇）lPZA（吡嗪酰胺）（吡嗪酰胺）l喹诺酮类喹诺酮类已确定的耐药的抗结核药物已确定的耐药的抗结核药物结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)的分子诊断的分子诊断耐药监测耐药监测55单耐药基因检测耐利福平：耐利福平：l突变一般发生在突变一般发生在RNA聚合酶聚合酶B亚单位编码基因（亚单位编码基因（rpoB基因）基因）l突变位点：突变位点：531位位 丝氨酸丝氨酸亮氨酸亮氨酸526位位 组氨酸组氨酸酪氨酸酪氨酸l

30、突变导致突变导致RFP 不能与不能与RNA聚合酶聚合酶B亚单位结合亚单位结合耐异烟肼：耐异烟肼：与三种基因突变有关与三种基因突变有关lkatG基因（突变位点：基因（突变位点：463位位 精氨酸精氨酸亮氨酸）亮氨酸）linhA基因（突变位点：基因（突变位点：94位位 丝氨酸丝氨酸丙氨酸）丙氨酸）lahpC基因基因结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)的分子诊断的分子诊断耐药监测耐药监测56l同时对利福平、异烟肼这两种或以上的抗结同时对利福平、异烟肼这两种或以上的抗结核药物耐药核药物耐药l大多数耐多药菌株是各种药物作用靶分子的大多数耐多药菌株是各种药物作用靶分子的编码基因逐步突变所致编码基因逐步突变所致

31、;靶结构变化与耐药靶结构变化与耐药水平有关水平有关l少数耐多药菌株是由一个耐多药位点的突变少数耐多药菌株是由一个耐多药位点的突变所致所致耐多药基因检测结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)的分子诊断的分子诊断耐药监测耐药监测57l样品的制备样品的制备lPCR扩增已知的与耐药有关的基因片段扩增已知的与耐药有关的基因片段l扩增产物耐药基因分析扩增产物耐药基因分析lSSCP（单链构象多态性分析）lRFLP（限制性片段长度多态性分析）lDNA序列分析耐药基因的检测方法结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)的分子诊断的分子诊断耐药监测耐药监测58需面对的问题需面对的问题l高费用高费用l感染与患病感染与患病l与传统医

32、学的矛盾与传统医学的矛盾l技术本身的缺陷（污染、生物安全）技术本身的缺陷（污染、生物安全）59其它需要关注的问题：其它需要关注的问题：l标本采集、运送和保存标本采集、运送和保存：供分离病毒、检出核酸及抗原的标本，要求做到：1.早：特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本。2.快：病毒离活体后在室温下很易死亡，故采得标本应尽快送检。不能及时检测的标本应放入装有冰块或干冰的容器内送检。短时间可低温保存，冻存的标本忌反复冻融。3.近：用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本应尽量取自病变部位或接近病变部位(如脑炎取脑脊液，腹泻取粪便，呼吸道感染取鼻咽分泌物或支气管灌洗液，有病毒血症时采取血液)。4.多：标本的量不能太少，如有可能一次取多种标本，在病程急性期和恢复期都取标本。5.净：避免污染标本，特别是用于病毒分离或PCR检测的标本l实验室生物安全保护实验室生物安全保护l实验室室内、室间质量控制实验室室内、室间质量控制60