基因工程常用技术课件.ppt

1、 第十四章第十四章基因工程常用技术基因工程常用技术 1.了解基因工程常用技术了解基因工程常用技术2.掌握细菌的转化和转染掌握细菌的转化和转染3.理解定点突变的诱发因素理解定点突变的诱发因素4.掌握核酸分子杂交掌握核酸分子杂交5.理解理解PCR技术技术6.理解理解DNA序列分析方法序列分析方法7.了解基因组文库的构建方法了解基因组文库的构建方法教学目的和要求教学目的和要求基因工程常用技术基因工程常用技术凝胶电泳凝胶电泳细菌的转化和转染细菌的转化和转染核酸分子杂交核酸分子杂交定点突变定点突变PCRRFLPRAPDDNA序列分析序列分析目的基因的分离和转基因植物、转基因动物等目的基因的分离和转基因植

2、物、转基因动物等技术。技术。凝胶电泳：凝胶电泳：分辨分辨DNA范围范围 使用浓度使用浓度 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 几百几百-2万万bp 0.3-2.0%聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 6-1000bp 3-20%凝胶电泳制备方法：凝胶电泳制备方法：样品制备样品制备凝胶制备凝胶制备电泳电泳染色染色观察。应观察。应用于分析；纯化。用于分析；纯化。细菌的转化和转染细菌的转化和转染转化：转化：指受体细胞从周围介质总共吸收外来指受体细胞从周围介质总共吸收外来DNA片段，使其基因型和表型发生相应变化片段，使其基因型和表型发生相应变化转染：转染：转化的特殊形式，是用离体状态的噬菌体、转化的特殊形式，是用离体状态

3、的噬菌体、病毒核酸感染细胞，以改变受体遗传组成病毒核酸感染细胞，以改变受体遗传组成v关键：关键：受体细胞是否处于感受态。诱导方法受体细胞是否处于感受态。诱导方法为：快速生长的细菌为：快速生长的细菌+0、CaCl2低渗溶液低渗溶液细胞肿胀呈球状（感受态）细胞肿胀呈球状（感受态）+DNA吸附吸附+42短暂处理短暂处理+MgCl2吸收吸收为防止限制，为防止限制，提高转化效率，可选用无限制作用的突变体。提高转化效率，可选用无限制作用的突变体。定点突变的诱发定点突变的诱发这项技术是加拿大的这项技术是加拿大的M.Smith70年代创造，获年代创造，获1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。也称位点专一诱变

4、。是一种反向遗传学方法。也称位点专一诱变。是一种反向遗传学方法。即将克隆基因在体外按预先的设计利用核酸酶、即将克隆基因在体外按预先的设计利用核酸酶、诱变剂等来诱发位点特异性突变，或将预先确诱变剂等来诱发位点特异性突变，或将预先确定的碱基改变引入人工合成的寡核苷酸再组入定的碱基改变引入人工合成的寡核苷酸再组入基因中，然后将已知缺失、插入、碱基替换、基因中，然后将已知缺失、插入、碱基替换、移码等不同类型的突变基因导入受体细胞，再移码等不同类型的突变基因导入受体细胞，再进行选择、分析突变表型。进行选择、分析突变表型。这里仅介绍寡核苷酸定点突变这里仅介绍寡核苷酸定点突变寡核苷酸定点突变寡核苷酸定点突变

5、原理及步骤原理及步骤核酸分子杂交核酸分子杂交1968年由年由Boy Britten等人发明等人发明原理：原理：DNA或或RNA（带互补的特定核苷酸序（带互补的特定核苷酸序列）列）混合（退火）混合（退火）同源区段形成双链结同源区段形成双链结构构杂种核酸分子（来源不同）杂种核酸分子（来源不同）类型：类型：Southern杂交；杂交；Northern杂交；原位杂交；原位杂交（杂交（boltting）Southern杂交：将电泳凝胶中的杂交：将电泳凝胶中的DNA片段转片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同移并结合在适当的滤膜上，然后通过同DNA或或RNA探针杂交检测同源片段的方法。见图探针杂交检测同

6、源片段的方法。见图Southern杂交杂交图图.Southern转移和分子杂交的过程转移和分子杂交的过程Northern杂交杂交又称又称RNA印迹技术，是将印迹技术，是将RNA分子从电泳凝分子从电泳凝胶转移到胶转移到NC滤膜上进行杂交的一项技术。滤膜上进行杂交的一项技术。由由J.C.Alwinex等在等在1979年建立年建立它与它与Southern杂交十分相似，不同之处只是从杂交十分相似，不同之处只是从凝胶中转移到滤膜的是凝胶中转移到滤膜的是RNA而不是而不是DNA类似的转移蛋白质的方法叫类似的转移蛋白质的方法叫Western杂交杂交应用应用Northern杂交技术可以了解特定基因的表杂交技术

7、可以了解特定基因的表达情况。达情况。原位杂交原位杂交在在Southern杂交技术的基础上发展起来的杂交技术的基础上发展起来的菌落（或噬菌斑）杂交，其方法是将培养皿中菌落（或噬菌斑）杂交，其方法是将培养皿中的菌落印迹到的菌落印迹到NC滤膜上，溶菌，使变性的滤膜上，溶菌，使变性的DNA与滤膜牢固结合。然后按照与滤膜牢固结合。然后按照Southern杂交杂交的方法进行分子杂交和显影。常用于目的克隆的方法进行分子杂交和显影。常用于目的克隆（菌落）的筛选。（见下图）（菌落）的筛选。（见下图）细胞和组织的原位杂交首先要制备组织样品，细胞和组织的原位杂交首先要制备组织样品，步骤包括组织固定、脱水、石蜡包埋和

8、切片。步骤包括组织固定、脱水、石蜡包埋和切片。转移至滤膜并在原位进行杂交，放射性同位素转移至滤膜并在原位进行杂交，放射性同位素标记的标记的DNA或或RNA探针与待测探针与待测DNA的互补配的互补配部位，可通过放射性自显影显示出来。部位，可通过放射性自显影显示出来。PCR技术技术PCR：polymerase chain reaction的缩写的缩写叫做聚合酶链式反应技术叫做聚合酶链式反应技术1985年，美国年，美国Kerry Mullis发明发明荣获荣获1993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖原理：引物延伸反应产生的子链原理：引物延伸反应产生的子链DNA经热变经热变性为单链后，有可作为模板，在引物和

9、性为单链后，有可作为模板，在引物和DNA聚合酶的作用下指导新的子链的合成。聚合酶的作用下指导新的子链的合成。需要：引物（一对）；酶（如需要：引物（一对）；酶（如TagDNA聚合聚合酶）；酶）；dNTP；缓冲液；水（超纯水）；缓冲液；水（超纯水）PCR扩增的几个方面扩增的几个方面关于扩增参数：关于扩增参数：启动温度启动温度循环循环 “变性变性”（94；30）“退火退火”（温度由引物确定；（温度由引物确定；30）“延伸延伸”（72；时间由扩增的长度而；时间由扩增的长度而定）。注：退火温度定）。注：退火温度4(G+C)+2(A+T)循环次数循环次数 2530次次最后延伸时间要长一些。最后延伸时间要长

10、一些。优点和问题：可对痕量优点和问题：可对痕量DNA进行大量扩增。进行大量扩增。TagDNA聚合酶复制忠实性差，错误掺入率为聚合酶复制忠实性差，错误掺入率为210-4，30轮后可达轮后可达0.25%，比，比Klenow酶高酶高4倍。倍。应用应用 gene扩增扩增探针制备探针制备临床临床法医学法医学RFLP和和RAPD技术技术RFLP：限制性片段长度多态性（：限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism）DNA分子（来源不同）；基因组分子（来源不同）；基因组DNA（不同（不同生物）生物）长度不同的限制性片段。对于一种酶长度不同的限制性片段

11、。对于一种酶和一种和一种DNA来说，所产生的限制性片段都是来说，所产生的限制性片段都是特异的，所以，这些片段的电泳图谱可以作为特异的，所以，这些片段的电泳图谱可以作为这种这种DNA的的“指纹指纹”，故又叫指纹分析。，故又叫指纹分析。RAPD：随机扩增多态性，用于：随机扩增多态性，用于DNA“个性个性”DNA样品样品PCR扩增扩增得到一组数目及长度得到一组数目及长度不同的不同的DNA片段片段电泳，电泳，EB染色染色电泳图谱电泳图谱DNA序列分析序列分析Maxam-Gilbert和和W.Gilbert建立建立基本原理：基本原理：DNA片段（末端带有放射性标记）片段（末端带有放射性标记）特定位点断裂

12、特定位点断裂一组长度不同的片段一组长度不同的片段电泳电泳自显影自显影X光片上显示谱带光片上显示谱带读出读出DNA碱基顺序。碱基顺序。步骤：化学降解时，将步骤：化学降解时，将DNA样品分为四份，放样品分为四份，放入不同的反应系统中。见下图入不同的反应系统中。见下图双脱氧双脱氧-M13体系体系DNA序列分析法序列分析法待测片段克隆到待测片段克隆到M13载体上，其优点载体上，其优点制备制备足够的足够的DNA片段片段使用一种通用引物使用一种通用引物M13复制产生的单链复制产生的单链DNA释放到细胞外。释放到细胞外。目的基因的分离目的基因的分离通常是先建立基因文库，然后从基因文库中筛通常是先建立基因文库

13、，然后从基因文库中筛选和鉴定含目的基因的克隆。选和鉴定含目的基因的克隆。基因文库（基因文库（gene library）：是指含有插入片）：是指含有插入片段的重组体段的重组体DNA分子的一个集合体，这些分分子的一个集合体，这些分子加在一起就构成了一个生物体的整个基因组。子加在一起就构成了一个生物体的整个基因组。（一）基因组文库的建立（一）基因组文库的建立cDNA文库：从某一生物或特定器官和组织中文库：从某一生物或特定器官和组织中获得的总获得的总DNA，经反转录产生，经反转录产生cDNA，以，以cDNA构建的克隆群体就叫这种生物（或器官构建的克隆群体就叫这种生物（或器官和组织）的和组织）的cDNA

14、文库。文库。主要优点：主要优点：筛选目的基因较容易，因为一个筛选目的基因较容易，因为一个完全完全cDNA基因文库所含的克隆数，比一个完基因文库所含的克隆数，比一个完全的基因组全的基因组DNA文库所含的克隆数要少的多文库所含的克隆数要少的多cDNA克隆中不存在内含子序列，这有利于克隆中不存在内含子序列，这有利于在原核细胞中表达。在原核细胞中表达。（二）基因组文库（二）基因组文库（genome bank）基因组文库即基因组文库即gDNA文库，是指包含某种生物的文库，是指包含某种生物的基因组全部基因组全部DNA的基因文库。哺乳类的基因文库多用的基因文库。哺乳类的基因文库多用 噬菌体构建，计算得到的噬

15、菌斑数目可确定基因文噬菌体构建，计算得到的噬菌斑数目可确定基因文库是否包括了库是否包括了99%的基因组的基因组DNA。基因组文库大小基因组文库大小：N=（1-p）/（1-f）N：所需的重组体数目；：所需的重组体数目；p：是从一个基因文库中分离得到的单拷贝基因的：是从一个基因文库中分离得到的单拷贝基因的 概率；概率；f：是外源：是外源DNA片段平均大小占整个基因组长度的片段平均大小占整个基因组长度的 百分数。百分数。该公式还可简化为该公式还可简化为N=4.61G/f，其中，其中G是基因组的大小是基因组的大小本章小结本章小结1.基因工程常用技术基因工程常用技术凝胶电泳、细菌的转化和转染、核酸分子杂交、定点凝胶电泳、细菌的转化和转染、核酸分子杂交、定点突变、突变、PCR、RFLP、RAPD、DNA序列分析、目的基序列分析、目的基因的分离和转基因植物转基因动物等技术因的分离和转基因植物转基因动物等技术2.细菌的转化和转染细菌的转化和转染3.定点突变的诱发定点突变的诱发4.核酸分子杂交核酸分子杂交Southern杂交、杂交、Northern杂交、原位杂交杂交、原位杂交5.DNA序列分析序列分析双脱氧双脱氧-M13体系体系DNA序列分析法序列分析法6.基因组文库的建立基因组文库的建立