免疫细胞的分离技术教学课件.ppt

1、2023-1-171免疫细胞的分离免疫细胞的分离2023-1-172免疫细胞免疫细胞v1、概念、概念 直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。v2、分类、分类 单核吞噬细胞系统：单核吞噬细胞系统：单核细胞单核细胞 /巨噬细胞巨噬细胞 树突状细胞（树突状细胞（DCs)DCs)淋巴细胞系统：淋巴细胞系统：T T 淋巴细胞淋巴细胞 （Th/Tc)Th/Tc)B B 淋巴细胞淋巴细胞 NK NK 细胞细胞 粒细胞系统粒细胞系统:中性粒细胞中性粒细胞 噬酸性粒细胞噬酸性粒细胞 噬碱性粒细胞噬碱性粒细胞2023-1-173免疫细胞的分离免疫细胞的分离v人外周

2、血单个核细胞的分离人外周血单个核细胞的分离v淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离v免疫细胞亚群的分离免疫细胞亚群的分离2023-1-174细胞分离原理细胞分离原理v细胞的大小和比重细胞的大小和比重v细胞表面标志细胞表面标志v细胞黏附于各种物质表面的特性细胞黏附于各种物质表面的特性2023-1-175 一、人外周血单个核细胞的分离一、人外周血单个核细胞的分离 Ficoll分层离心法人外周血单个核细胞人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte。血液中各细胞成分的比重不同，经离心血液中各细胞成分的比重不同，经离心

3、沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯的单个核细胞，其中淋巴细胞占的单个核细胞，其中淋巴细胞占90%以上。以上。2023-1-176不同细胞密度不同不同细胞密度不同 红细胞和多形核白细胞红细胞和多形核白细胞 1.092 单个核细胞单个核细胞 1.070 分层液分层液 1.0772023-1-177一、人外周血单个核细胞的分离一、人外周血单个核细胞的分离 Ficoll分层离心法Ficoll分层液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。2023-1-178二、淋巴细胞的分离二、淋巴细胞的分离v尼龙棉柱法尼龙棉柱法vE花环分离法花环分离法v补体

4、细胞毒法免疫荧光补体细胞毒法免疫荧光法法 2023-1-179二、淋巴细胞的分离二、淋巴细胞的分离 尼龙棉柱法尼龙棉柱法：B细胞和单核细胞具有细胞和单核细胞具有易黏附易黏附的特性，的特性，将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，37 作作用用12h后，洗脱的为非黏附性的后，洗脱的为非黏附性的T细胞。细胞。PBMC尼龙纤尼龙纤维棉柱维棉柱B细胞细胞单核细胞单核细胞T细胞细胞10 二、淋巴细胞的分离二、淋巴细胞的分离 E花环分离法（纯化花环分离法（纯化T细胞）细胞）2023-1-1711三、免疫细胞亚群的分离三、免疫细胞亚群的分离v免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法v流式细胞术流

5、式细胞术12三、免疫细胞亚群的分离三、免疫细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB），免疫磁），免疫磁珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连，相连，在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的。分离的目的。2023-1-1712免疫细胞的分离13 三、免疫细胞亚群的分离三、免疫细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法v1.直接法：抗细胞表面分子抗体+磁性微球 免疫磁珠免疫磁珠+细胞悬液 与免疫磁珠结合的

6、细胞v2.间接法：第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞 特定细胞141516免疫磁珠法分选装置免疫磁珠法分选装置2023-1-1717三、免疫细胞亚群的分离三、免疫细胞亚群的分离 流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。不同类型的细胞分选收集。细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。

7、当细胞从流动室喷胞排成单行，逐个流经检测区。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声震动液流，使液流段裂成一连串嘴处流出时，超声震动液流，使液流段裂成一连串的均匀小滴，每个小滴内最多含一个细胞，细胞经的均匀小滴，每个小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。2023-1-1718流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理2023-1-1719流式细胞仪流式细胞仪20免疫细胞的分离免疫细胞的分离v人外周血单个核细胞的分离人外周血单个核细胞的分离Ficoll分层离分层离 心法心法v淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离尼龙棉柱法、尼龙棉柱法、E花环花环分离法、补体细胞毒法免疫荧光法分离法、补体细胞毒法免疫荧光法v免疫细胞亚群的分离免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法、免疫磁珠分离法、流式细胞术流式细胞术2023-1-1721谢谢！