DNa重组技术的基本工具(市公开课)课件.ppt

1、2基因工程的概念n基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的别名基因工程的别名基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物34抗虫害的玉米抗虫害的玉米

2、转鱼抗寒基因的番茄转鱼抗寒基因的番茄转基因转基因鲑鱼鲑鱼基因工程产品5转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒乳汁中含有人生长激素的转基因牛乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿阿根廷根廷)6基础理论和技术的发展催生了基因工程 nDNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明nDNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立n遗传密码的破译遗传密码的破译n基因转移载体的发现基因转移载体的发现n工具酶的发明工具酶的发明nDNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明nDNA体外重组的实现体外重组的实现n重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功n第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世nP

3、CR技术的发明技术的发明基础理论基础理论技术发明技术发明7基因操作的基本步骤8DNA重组技术的基本工具 n限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”nDNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”n基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”9(一)限制性核酸内切酶“分子手术刀”分布：主要在原核生物中分布：主要在原核生物中作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点割特定切点切点：磷酸二酯键切点：磷酸二酯键举例：举例：EcoRI限制酶能识别限制酶能识别GAATTC序列，并序列，并在在G和和A之间切开之间切开10

4、磷酸二酯磷酸二酯键键12345123451112重播重播131415限制性核酸内切酶限制酶限制酶16黏性末端和平末端1718限制酶在原核生物中的作用 n原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵侵入时，会利用限制酶将外源入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主切割掉，以保证自身的安全。

5、所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。、使之失效，从而达到保护自身的目的。n含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。19（二）DNA连接酶“分子缝合针”n连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli DNA连接酶。另一种是从连接酶。另一种

6、是从T4噬噬菌体中分离得到，称为菌体中分离得到，称为T4 DNA连接酶。连接酶。n这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链的缺口，而不能连接单链DNA。nEcoli DNA连接酶只能连接黏性末端；连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可连接酶既可“缝合缝合”黏性末端，又可黏性末端，又可“缝合缝合”平末端。平末端。20DNA连接酶“分子缝合针”nDNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？聚合酶一样吗？为什么？21思考：思考：DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？相同点：相同点：

7、都是形成磷酸二酯键都是形成磷酸二酯键 不同点不同点DNA聚合酶：以聚合酶：以DNA单链为模板，将单个核苷酸通过单链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成另一条互补的磷酸二酯键形成另一条互补的DNA单链。单链。DNA连接酶：在两个连接酶：在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，片段之间形成磷酸二酯键，即把即把DNA双链上的两个缺口同时连接起来。双链上的两个缺口同时连接起来。ATCGTAGCATCGTAGC限制酶作用：使磷酸二酯键断裂限制酶作用：使磷酸二酯键断裂解旋酶作用：使双链间的氢键断裂解旋酶作用：使双链间的氢键断裂22质粒 质粒是基因工程最常用的运载体，质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在

8、于细菌、酵母菌中，是它广泛地存在于细菌、酵母菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的细菌染色体外能够自主复制的很小的环状环状DNA分子，大小只有普通细菌拟分子，大小只有普通细菌拟核核DNA的百分之一。的百分之一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造基因的载体“分子运输车”23基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体作为载体没有切割位点将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？如果载体对受体细胞有害

9、将怎样？24基因的载体“分子运输车”载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害、对受体细胞无害常用的载体有：常用的载体有：质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等噬菌体的衍生物，动植物病毒等25基因工程基因工程科技探索之路科技探索之路-基本理论和技术的发展基本

10、理论和技术的发展 催生了基因工程催生了基因工程概念概念基本操作程序基本操作程序应用应用“分子手术刀分子手术刀”：限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶“分子缝合针分子缝合针”：DNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”：载体：载体来源来源作用作用结果结果分类分类作用作用常用载体常用载体载体的条件载体的条件其它载体其它载体基本工具基本工具261 1、下列不适合用于基因工程的运载体、下列不适合用于基因工程的运载体是（是（）A A、质粒、质粒 B B、噬菌体、噬菌体 C C、细菌、细菌 D D、病毒、病毒选选我我C2、下列说法正确的是：（、下列说法正确的是：（）A、限制酶的切口一定是、限制酶的切口一定是

11、GAATTC碱基序列碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体连接酶、运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因、利用运载体在宿主细胞内对目的基因 进行大量复制的过程可称为进行大量复制的过程可称为“克隆克隆”选选我我D审题审题273、下列黏性末端属于同种限制酶切割而成的、下列黏性末端属于同种限制酶切割而成的 是（是（）A、B、C、D、T C GA G C T T A AA GG T T C C AA G C T T C A G A A T T C G4 4、下列哪一种酶是基因工程的工

12、具酶（、下列哪一种酶是基因工程的工具酶（）A A、DNADNA连接酶连接酶 B B、DNADNA酶酶 C C、RNARNA酶酶 D D、运载体、运载体选选我我A选选我我A记住了记住了285、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（片段，需使用（）A.同种限制酶同种限制酶 B.两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶 D.两种连接酶两种连接酶29基因操作的基本步骤303132基因操作的基本步骤提取目的基因提取目的基因 从供体细胞的DNA中直接分离基因（如“鸟枪法”）人工合成基因反转录法化学合成法 目的基因是人们所需要转移或改造的基

13、因。如苏云金芽孢杆菌目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。三种目的基因提取方法的优缺点三种目的基因提取方法的优缺点仅限于合成核苷酸对较少的简单基因仅限于合成核苷酸对较少的简单基因专一性专一性最强最强化学化学合成法合成法操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要求的技术条件较很不稳定，要求的技术条件较高高专一性强专一性强反转录法反转录法工作量大，盲目，分离出来的

14、有时并非一个基因工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因操作简便广泛使用操作简便广泛使用鸟枪法鸟枪法缺缺 点点优优 点点目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达 检测：通过检测标记基因的有无来判断目的基因是否导入。检测：通过检测标记基因的有无来判断目的基因是否导入。表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。33

15、基因操作的基本步骤目的基因导入受体细胞的方法目的基因导入受体细胞的方法1、将细菌用、将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2、使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。、使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3、目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内、目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。就能获得大量的目的基因。34基因操作的基本步骤35基因工程的成果与发展前景 基因工程与医药卫生基因工程与医药卫生生产基因工程药品生产基因工程药品用于基因诊断与基因治疗

16、用于基因诊断与基因治疗 基因工程与农牧业、食品工业基因工程与农牧业、食品工业培育高产、稳产和具有优良品质的动植物新品种培育高产、稳产和具有优良品质的动植物新品种培育具有各种抗逆性的动植物新品种培育具有各种抗逆性的动植物新品种为人类开辟新的食物来源为人类开辟新的食物来源基因工程与环境保护基因工程与环境保护用于环境监测用于环境监测用于被污染环境的净化用于被污染环境的净化36基因工程与医药卫生我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物1 1、基因工程药品的生产、基因工程药品的生产 微生物生长迅速，容易控制，适微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。如利用大肠杆于大规模工

17、业化生产。如利用大肠杆菌生产胰岛素、干扰素、白细胞介菌生产胰岛素、干扰素、白细胞介素素22等。既增加产量，又降低成本。等。既增加产量，又降低成本。37基因工程与医药卫生2 2、基因诊断、基因诊断基因诊断是用放射性同位素基因诊断是用放射性同位素(如如32P)32P)、荧光分子等标记的、荧光分子等标记的DNADNA分子做探针，利用分子做探针，利用DNADNA分子杂交分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。生物芯片生物芯片 从正常人的基因组中分离出从正常人的基因组中分离出DNADNA与与DNADNA芯片杂交就可以得出标准图谱

18、。从病人的基因组中分离出芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNADNA与与DNADNA芯片杂交就可以得出病变图谱。芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNADNA信息。信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。诊断新技术。38基因工程与医药卫生3 3、基因治疗、基因治疗基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。基因治疗是把健康的外源基因导

19、入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。取患者骨髓分离干细胞病毒正常基因并入正常基因的干细胞注入患者体内39基因工程与农牧业、食品工业生长快、肉质好的转基因鱼生长快、肉质好的转基因鱼(中国中国)乳汁中含有人生长激素的转基因牛乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷阿根廷)40基因工程与农牧业、食品工业转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄转鱼抗寒基因的番茄41基因工程与农牧业、食品工业42基因工程与农牧业、食品工业43基因工程与农牧业、食品工业44基因工程与环境保护1 1、环境监测、环境监测 基因工程做成的基因工程做成的DNADNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒

20、、细菌等污染。探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的利用基因工程培育的“指示生物指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。2 2、环境污染治理、环境污染治理基因工程做成的基因工程做成的“超级细菌超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。能吞食和分解多种污染环境的物质。451、有些转基因食物含的一些物质，可能会影响人体健康。、有些转基因食物含的一些物质，可能会影响人体健康。2、大量的转基因生物进入自然界后很可能会与野生物种进行杂交，产生一些超级生物，从而造成、大量的转基因生物进入自然界后很可能会与野生物种进行杂交，产生一些超级生物，从而造成基因污染。基因污染。3、如有些作物插入抗虫基因，杀死环境中有益的生物。、如有些作物插入抗虫基因，杀死环境中有益的生物。基因工程的弊端 结结 语语