酶工程制药二培训教材课件.ppt

1、酶工程制药二文档ppt制备具有酶活性的分子印迹酶，要选择合适的印迹分子，目前所选择的印迹分子主要有底物、底物类似物、酶抑制剂、过渡态类似物和产物等。因此，酶在有机相中的稳定化研究具有重要的意义。（3）固定化大肠杆菌反应堆制备 将上述充分洗涤后的固定化大肠杆菌细胞装填于带保温夹套的填充式反应器中，即成为固定化大肠杆菌反应堆，反应器规格为直径70*160厘米。酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。双功能试剂，戊二醛，二胺；核糖核酸经磷酸二脂酶作用，可分解为腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷等一磷酸化合物，该磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞、麦芽根等生物材料中，本法以麦芽根为材料制备

2、磷酸酶。（6）抗体库法用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的可变区基因。切割RNA的DNA分子，称之为脱氧核酶。底物不溶于水，或酶的米式常数过高；5倍体积的5度95%冷工业酒精，5度静置23小时后，吸去上层清夜，回收乙醇，下层离心收集沉淀，用少量丙酮以乙醚先后洗涤23次，真空干燥，粉碎得到磷酸二脂酶，备用。根据其催化的反应可分为两大类印迹方法共价分子印迹和非共价分子印迹。切割RNA的DNA分子，称之为脱氧核酶。（3）熵阱法利用抗体结合能克服反应熵垒来设计半抗原。5倍体积的5度95%冷工业酒精，5度静置

3、23小时后，吸去上层清夜，回收乙醇，下层离心收集沉淀，用少量丙酮以乙醚先后洗涤23次，真空干燥，粉碎得到磷酸二脂酶，备用。水水不溶性溶剂两相体系；2升每分流速洗脱，当流出液pH达到7时开始部分收集，直至洗脱液中不含核苷酸为止，合并含核苷酸钠的洗脱液进行精制。剪切型核酶 催化自身或异体RNA的切割，相当于内切核酸酶，主要包括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白质RNA复合酶（RNaseP）。合适比例的混合液可直接注入体内补充营养，氨基酸作为增味剂，可增加香味促进食欲，还可作为饲料制造人造纤维、塑料等。另取湿ABXE纤维素40公斤，加入05度蒸馏水至80升，搅拌下先后加入1摩尔每升盐酸

4、和5%亚硝酸钠溶液各10升，搅拌均匀，于05度下反应，150分，抽滤，滤饼迅速用预冷的0.优良的模拟酶环糊精（cyclodextrin，CD）。6氨基青霉烷酸是生产半合成青霉素的最基本原料。通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，利用此技术可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。三、固定化酶法生产L氨基酸高分子多聚物，聚乙二醇，聚乙烯醇；1、有机相酶反应的优点应用范围分子印迹聚合物可作为剪裁分离物质的材料；青霉素G经青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为6氨基青霉烷酸，也称无侧链青霉素。模拟水解酶的胶束酶模型固定化酶方法简单，可以只沉淀

5、在载体表面。5%硫酸铵溶液溶解，过滤得到酶液。三、固定化酶法生产L氨基酸可抑制有水参与的副反应；切割RNA的DNA分子，称之为脱氧核酶。在有机相中，天然酶容易变性而失活、分散性差、容易聚结成团。固定化酶方法简单，可以只沉淀在载体表面。肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。通过酰化反应可改变侧链羟基的性质。稳定性提高、抗各类失活因子的能力提高、抗原性消除、体内半衰期延长、最适酸度改变、酶学性质改变，对组织分布能力改变。酶不溶于有机溶剂，易于回收在利用；对于任何分子，几乎都可以通过免疫系统产生相应的抗体，而且专一性很强，抗体的这种多样性标志着抗体酶的应用潜力是巨大的。1、选定印

6、迹分子和功能单位，让它们之间发生互补作用，形成印迹分子功能单位复合物。青霉素G经青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为6氨基青霉烷酸，也称无侧链青霉素。酶的化学修饰和表面活性剂包埋 可以增加酶表面的疏沙发一，改善酶在有机相中的脂溶性和稳定性，提高酶的催化效率。双功能试剂，戊二醛，二胺；酶活力 疏水性越强的溶剂，其中酶所要求的水量越少；5复合单核苷酸可用于治疗白血球下降、血小板减少以及肝功能失调等疾病。底物不溶于水，或酶的米式常数过高；酶的稳定性 有机溶剂中的水含量对溶剂中酶的稳定性影响很大；1、磷酸二脂酶的制备 取干麦芽根，加910倍体积的水，用2摩尔每升的盐酸调酸度至5.可抑制有水参与的

7、副反应；酶的化学修饰和表面活性剂包埋 可以增加酶表面的疏沙发一，改善酶在有机相中的脂溶性和稳定性，提高酶的催化效率。以蛋白质为基础制备生物印迹酶的主要过程为使蛋白质部分变性；酶活力 疏水性越强的溶剂，其中酶所要求的水量越少；5复合单核苷酸可用于治疗白血球下降、血小板减少以及肝功能失调等疾病。水水溶性溶剂均相体系；2、固定化磷酸二脂酶的制备 取上述磷酸二脂酶200克，用1.优良的模拟酶环糊精（cyclodextrin，CD）。以往采用化学合成、微生物发酵及生物材料提取等传统技术生产的药品，都可以通过酶工程生产，甚至可以获得传统技术不可能得到的昂贵药品。（1）大肠杆菌的培养 斜面培养基为普通肉汤琼

8、脂培养基，发酵培养基的成分为蛋白胨、氯化钠、苯乙酸、自来水。热力学平衡向合成方向移动；1、有机相酶反应的优点常用修饰剂糖及糖的衍生物，右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝胶，聚乳；酶活力 疏水性越强的溶剂，其中酶所要求的水量越少；目前比较重要的胶束酶模型有酶活力 疏水性越强的溶剂，其中酶所要求的水量越少；按照模拟酶的属性，可分为（6）抗体库法用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的可变区基因。切割RNA的DNA分子，称之为脱氧核酶。酶选择性 取决于酶分子的结构，会因酶所处的溶剂不同而发生巨大变化。水

9、水不溶性溶剂两相体系；可抑制有水参与的副反应；用这种方法可以制备生物印迹酶。有机溶剂中酶的热稳定性随系统水含量增加而下降。以天然酶为母体，用化学方法或基因工程方法引进适当的活性部位或催化基团，从而形成一种新的人工酶。根据其催化的反应可分为两大类剪切型核酶 催化自身或异体RNA的切割，相当于内切核酸酶，主要包括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白质RNA复合酶（RNaseP）。催化活性基团的引入将催化基团定位在印迹空腔的合适位置对印迹酶发挥催化效率相当重要。单纯合成的酶样化合物一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。酶工程具有技术先进、厂房设备投盗小、工艺简单、能耗量低、产品收率高

10、、效率高、效益大、污染轻等优点。可抑制有水参与的副反应；（4）多底物类似法将酶催化反应的辅因子引入到抗体结合部位，产生既有辅因子结合部位，又有底物结合部位的抗体固定化酶 不仅使酶在有机相中易于分散，提高扩散效果，而且能增加其稳定性，还可以调节和控制酶的活性与选择性，有利于酶的回收和连续化生产。以蛋白质为基础制备生物印迹酶的主要过程为使蛋白质部分变性；（1）大肠杆菌的培养 斜面培养基为普通肉汤琼脂培养基，发酵培养基的成分为蛋白胨、氯化钠、苯乙酸、自来水。（2）印迹分子与单体相互作用的类型主客体化学和超分子化学已经成为酶人工模拟的重要理论基础，是人工模拟酶研究的重要理论武器。（1）大肠杆菌的培养

11、斜面培养基为普通肉汤琼脂培养基，发酵培养基的成分为蛋白胨、氯化钠、苯乙酸、自来水。（4）酶与高分子化合物结合，蛋白质或多糖结合后可提高稳定性。其他，固定化酶载体，糖基化试剂，甲基化试剂，乙基化试剂和小分子有机化合物。核糖核酸经磷酸二脂酶作用，可分解为腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷等一磷酸化合物，该磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞、麦芽根等生物材料中，本法以麦芽根为材料制备磷酸酶。（3）熵阱法利用抗体结合能克服反应熵垒来设计半抗原。透析等方法除去印迹分子。水水溶性溶剂均相体系；（6）抗体库法用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的

12、抗体分子片段，从中筛选特异性的可变区基因。制备具有酶活性的分子印迹酶，要选择合适的印迹分子，目前所选择的印迹分子主要有底物、底物类似物、酶抑制剂、过渡态类似物和产物等。因此，酶在有机相中的稳定化研究具有重要的意义。单纯合成的酶样化合物一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。双功能试剂，戊二醛，二胺；2、固定化磷酸二脂酶的制备 取上述磷酸二脂酶200克，用1.在有机相中，天然酶容易变性而失活、分散性差、容易聚结成团。切割RNA的DNA分子，称之为脱氧核酶。除了环糊精等天然存在的宿主酶模型外，人们还合成了冠醚、穴醚、环番、环芳烃等大环多齿配体来构建酶模型。（3）熵阱法利用抗体结合能克服反应熵垒来

13、设计半抗原。水水不溶性溶剂两相体系；酶的化学修饰和表面活性剂包埋 可以增加酶表面的疏沙发一，改善酶在有机相中的脂溶性和稳定性，提高酶的催化效率。通过酰化反应可改变侧链羟基的性质。热力学平衡向合成方向移动；应用范围分子印迹聚合物可作为剪裁分离物质的材料；能测定某些在水介质中不能测定的常数；（1）大肠杆菌的培养 斜面培养基为普通肉汤琼脂培养基，发酵培养基的成分为蛋白胨、氯化钠、苯乙酸、自来水。固定化酶 不仅使酶在有机相中易于分散，提高扩散效果，而且能增加其稳定性，还可以调节和控制酶的活性与选择性，有利于酶的回收和连续化生产。固定化酶 不仅使酶在有机相中易于分散，提高扩散效果，而且能增加其稳定性，还

14、可以调节和控制酶的活性与选择性，有利于酶的回收和连续化生产。酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。合适比例的混合液可直接注入体内补充营养，氨基酸作为增味剂，可增加香味促进食欲，还可作为饲料制造人造纤维、塑料等。固定化酶方法简单，可以只沉淀在载体表面。（2）印迹分子与单体相互作用的类型（4）多底物类似法将酶催化反应的辅因子引入到抗体结合部位，产生既有辅因子结合部位，又有底物结合部位的抗体这些离子的作用是中和DNA单链上的负电荷，从而增加单链DNA的刚性；稳定性提高、抗各类失活因子的能力提高、抗原性消除、体内半衰期延长、最适酸度改变、酶学性质改变，对组织分布能力改变。第七节 酶工程

15、产品制造实例2、固定化磷酸二脂酶的制备 取上述磷酸二脂酶200克，用1.水水溶性溶剂均相体系；双功能试剂，戊二醛，二胺；Klibanov等人打破传统酶学思想的束缚，将酶引入到非水介质中进行催化反应，开辟了非水酶学（nonaqueous enzymology）这一新的研究领域，极大地拓宽了酶的应用范围。分子表面有较多的反应活性基团；该特定分子称为印迹分子或模板。以天然酶为母体，用化学方法或基因工程方法引进适当的活性部位或催化基团，从而形成一种新的人工酶。可抑制有水参与的副反应；L氨基酸可化学合成，但化学合成得到的是混旋体，还需拆分，拆分方法有物理化学法、酶法等，其中酶法最为有效，产生的产物纯度较

16、高。酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。单纯合成的酶样化合物一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。（1）稳定过渡态法用类似于反应过渡态的小分子作为半抗原，产生相应的抗体而获得。（6）抗体库法用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的可变区基因。5%硫酸铵溶液溶解，过滤得到酶液。核糖核酸经磷酸二脂酶作用，可分解为腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷等一磷酸化合物，该磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞、麦芽根等生物材料中，本法以麦芽根为材料制备磷酸酶。利用金属螯合作用发挥空间诱导效应；1、有

17、机相酶反应的优点每个葡萄糖残基呈现椅式构象，整个分子类似环柱形分子，由于环糊精分子空穴边缘有许多羟基，能溶于水，空穴内基本是疏水的。（5）6氨基青霉烷酸的提取 上述转化液经过滤澄清后，滤液用薄膜浓缩器减压浓缩至100升左右，冷却至室温后，于250升搅拌罐中加50升醋酸丁脂充分搅拌提取1015分，取下层水相，加1%克每毫升活性炭于70度搅拌脱色30分，滤除活性炭，滤液用6摩尔每升盐酸调酸度至4左右，5度放置结晶过夜，次日滤取结晶，用少量冷水洗涤，抽干，115烘23小时得成品6氨基青霉烷酸，收率为7080%。工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；（3）固定化大肠杆菌反应堆

18、制备 将上述充分洗涤后的固定化大肠杆菌细胞装填于带保温夹套的填充式反应器中，即成为固定化大肠杆菌反应堆，反应器规格为直径70*160厘米。（1）大肠杆菌的培养 斜面培养基为普通肉汤琼脂培养基，发酵培养基的成分为蛋白胨、氯化钠、苯乙酸、自来水。能提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包结络合物，以此影响和催化一些反应。主客体化学和超分子化学加入印迹分子，使之与部分变性的蛋白质充分结合；酶工程具有技术先进、厂房设备投盗小、工艺简单、能耗量低、产品收率高、效率高、效益大、污染轻等优点。用氢氧化钠调酸度为7.用这种方法可以制备生物印迹酶。1、选定印迹分子和功能单位，让它们之间发生互补作用，

19、形成印迹分子功能单位复合物。容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物；利用过渡态类似物制备抗体酶主客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作用，体现为主体和客体在结合部位的客间及电子排列的互补。水水不溶性溶剂两相体系；应用范围分子印迹聚合物可作为剪裁分离物质的材料；剪切型核酶 催化自身或异体RNA的切割，相当于内切核酸酶，主要包括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白质RNA复合酶（RNaseP）。酶不溶于有机溶剂，易于回收在利用；这些离子的作用是中和DNA单链上的负电荷，从而增加单链DNA的刚性；分子表面有较多的反应活性基团；三、固定化酶法生产L氨基酸酶分子经过化学修饰后，并不是所有的缺点都

20、可以克服了，并且修饰的结果难以预测，今后，应选用更多的、合适的修饰方法，如使用基因工程法、蛋白质工程法、人工模拟法和某些物理修饰法等，使酶的性质进一步改善。4、5复合单核苷酸的分离纯化 将上述转化液用6摩尔每升的盐酸调酸度至3，滤除沉淀，滤液用6摩尔每升氢氧化钠调酸度至7，进入已处理好的氯型阴离子交换树脂柱，流速为22.用氢氧化钠调酸度为7.1、有机相酶反应的优点共价 分子印迹印迹分子与功能基团形成共价键，在与交联剂发生共聚合后，用化学方法将印迹分子从这个高度交联的聚合物上除去。常用修饰剂糖及糖的衍生物，右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝胶，聚乳；1、有机相酶反应的优点可抑制有水参与的副

21、反应；催化抗体是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，因此也叫抗体酶。酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。（6）抗体库法用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的可变区基因。利用过渡态类似物制备抗体酶1、酶基因的克隆和表达催化抗体是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，因此也叫抗体酶。剪切型核酶 催化自身或异体RNA的切割，相当于内切核酸酶，主要包括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白质RNA复合酶（RNaseP）。利用抗体能与抗原特异性结合的原理，可用过渡态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡态分子，从而降低反应的活化能，达到催化反应的目的，这种抗体便称为催化抗体。以天然酶为母体，用化学方法或基因工程方法引进适当的活性部位或催化基团，从而形成一种新的人工酶。（2）抗体与半抗原互补法利用抗体半抗原互补性产生抗体酶，通过半抗原的优化设计使之正确模仿过渡态的几何结构及所有的反应键，从而产生高活力的抗体酶。2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚合反应，形成交联的聚合物。