酶工程酶和细胞的固定化培训课件.ppt
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- 工程 细胞 固定 培训 课件
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1、酶工程酶和细胞的固定化(优选)酶工程酶和细胞的固(优选)酶工程酶和细胞的固定化定化果葡糖浆:葡萄糖异构果葡糖浆:葡萄糖异构酶酶/木糖异构酶木糖异构酶异麦芽酮糖:蔗糖变位酶异麦芽酮糖:蔗糖变位酶阿斯巴甜:嗜热菌蛋白酶阿斯巴甜:嗜热菌蛋白酶6-氨基青霉烷酸(氨基青霉烷酸(6-APA):):青霉素酰化酶青霉素酰化酶7-氨基头孢烷酸(氨基头孢烷酸(7-ACA):):D-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶苯乙醇胺(又用作苯乙醇胺(又用作瘦肉精):脂肪酶瘦肉精):脂肪酶丙烯酰胺:腈水解酶丙烯酰胺:腈水解酶氨基酸:氨基氨基酸:氨基酰化酶酰化酶/酰脲酶酰脲酶果葡糖浆果葡糖浆葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶青霉素酰化酶青霉素酰化
2、酶 6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸Immobilization,Why?EnzymepropertiesImmobilized Enzyme or cell?Carrier properties Immobilized effectImmobilizedMethods&ParametersGroup,charge&hydrophobicity Contents of chapter 44.2 固定化的载体和方法4.3 固定化酶的性质GoGo4.1 固定化的目的和定义Go4.4 应用实例Go4.14.1 固定化的目的和定义固定化的目的和定义Why?成本高成本高生产过程生产过程难以连续难以连续 产物
3、分离产物分离困难困难利用率低利用率低稳定性差稳定性差反应过程反应过程难以控制难以控制游离酶游离酶/细胞细胞:Why?成本成本反复反复/连续连续生产过程生产过程 产物分离产物分离容易容易利用率利用率稳定性稳定性固定化酶固定化酶/细胞细胞:反应过程反应过程易控制易控制 固定化酶固定化酶/细胞技术是指利用细胞技术是指利用物理或化学特定的手物理或化学特定的手段段,将游离的酶或细胞,将游离的酶或细胞定位定位,或,或限制限制于特定的空间于特定的空间区域,使其区域,使其保持催化活性保持催化活性,并可,并可反复使用反复使用的技术。的技术。定义定义固定化酶固定化酶酶需要分离纯化;酶需要分离纯化;酶活力有损失;酶
4、活力有损失;不适合多酶反应;不适合多酶反应;催化效率高,节省空间催化效率高,节省空间固定化细胞固定化细胞无需酶的分离纯化无需酶的分离纯化酶活损失小,更稳定酶活损失小,更稳定多酶体系,无需辅酶再生多酶体系,无需辅酶再生生产成本低生产成本低4.24.2 固定化的载体和方法固定化的载体和方法Carriers化学性质要求化学性质要求亲水性亲水性/疏水性疏水性膨胀系数膨胀系数低低稳定性稳定性高高形态学性质要求形态学性质要求粒径小,粒度分布窄粒径小,粒度分布窄内表面积内表面积大大孔径孔径足够大足够大机械性质要求机械性质要求耐压性耐压性高高可压缩性可压缩性低低弹性弹性足够足够其他要求其他要求来源来源广泛广泛
5、成本成本低低食品级(用于食品工业)食品级(用于食品工业)载体孔径大于酶载体孔径大于酶分子大小,以保分子大小,以保证酶构象的自由证酶构象的自由变化,提高酶活,变化,提高酶活,降低空间位阻。降低空间位阻。被吸附到空穴内壁的酶分子被吸附到空穴内壁的酶分子Eupergit C孔径孔径10-20nm酶活力较低酶活力较低依赖于孔径依赖于孔径Eupergit 250L孔径孔径100nm酶活力高酶活力高酶负载高酶负载高载体孔径及分布载体孔径及分布扩散限制可以克服时,扩散限制可以克服时,载体最小孔径是多少?载体最小孔径是多少?rp20+de一般最小孔径一般最小孔径 2rp=40+2de酶直径酶直径de孔半径孔半
6、径rp若酶分子直径若酶分子直径5nm,最,最小载体孔径应为小载体孔径应为50nm与游离酶相比,固定化酶的最适温度一般变化不大,部分酶固定化后最适温度发生明显变化。阿斯巴甜:嗜热菌蛋白酶1 固定化的目的和定义如:天然牛血清胺氧化酶PEG化,再与水凝胶作用果葡糖浆:葡萄糖异构酶/木糖异构酶与游离酶相比,固定化酶的最适温度一般变化不大,部分酶固定化后最适温度发生明显变化。酶吸附固定化的不同方法环节支持物表面的毒性固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有关。酶分子包在高聚物格子中基于Eupergit载体1g/60mL酶液扩散限制可以克服时,载体最小孔径是多少?己二胺(hexamethylenediam
7、ine交联时的 pH 值一般与酶的等电点 pI 相同包埋于聚丙烯酰胺凝胶交联反应条件剧烈,而且交联需酶分子中的多个基团同时参与,致使酶活力损失较大ABSE-交联琼脂 3g水,醋酸钠溶液洗涤固定化酶9 Mercury-酶相互作用孔径、比表面积、酶负载量的关系孔径、比表面积、酶负载量的关系该图中该图中随孔径增大随孔径增大,酶,酶所占据的所占据的内表面积越小内表面积越小,酶负载量越小。酶负载量越小。固定化酶的固定化酶的比活力比活力起初起初随孔径增大而减小;载随孔径增大而减小;载体孔径大于体孔径大于60nm时,酶时,酶活力增加,说明扩散限活力增加,说明扩散限制越来越小。制越来越小。菊糖酶菊糖酶固定在可
8、控孔的固定在可控孔的二氧化硅载体上二氧化硅载体上无机载体无机载体高压稳高压稳定性定性搅拌器中搅拌器中易受磨损易受磨损vs多孔玻璃多孔玻璃SiO2硅藻土硅藻土 SiO2斑脱土斑脱土(膨润土膨润土)Al2Mg3Si4H2O121.5g青霉素酰化酶青霉素酰化酶/1g斑脱土斑脱土无机载体无机载体应用应用功能基团功能基团制造商制造商多孔玻璃多孔玻璃SiO2实验室实验室-OHCorning(USA)Waters(USA)Schuller(D)多孔硅胶多孔硅胶 SiO2工业规模工业规模-OHGrace(USA)(商品名(商品名Deloxan)Solvay(D)Degussa(D)明矾硅石明矾硅石-OH介孔分
9、子筛介孔分子筛MCM-41实验室实验室有机载体有机载体天然高分子,如多糖类天然高分子,如多糖类与蛋白质的与蛋白质的相容性较好相容性较好琼脂糖琼脂糖宽网状,亲水性,宽网状,亲水性,与酶作用弱,酶不易失活与酶作用弱,酶不易失活纤维素纤维素功能化:功能化:CM(羧甲基羧甲基)-纤维素纤维素DEAE(二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基)-纤维素纤维素工业:工业:DEAE-纤维素用于纤维素用于葡萄糖异构酶固定化,葡萄糖异构酶固定化,1986葡聚糖葡聚糖机械稳定性机械稳定性低,来源受限低,来源受限水溶性,实验室水溶性,实验室实验室实验室有机载体有机载体合成聚合物载体合成聚合物载体化学和机械化学和机械稳定性高稳定
10、性高性能优良性能优良操作简单操作简单离子交换树脂离子交换树脂聚甲基丙烯酸衍生物聚甲基丙烯酸衍生物聚丙烯酸酯衍生物聚丙烯酸酯衍生物固定化脂肪酶催化非水系统反应固定化脂肪酶催化非水系统反应新型载体新型载体磁性高分子微球磁性高分子微球高分子复配载体:高分子复配载体:两种及以上高分子体系,经氢两种及以上高分子体系,经氢键、疏水作用等次级键聚集,键、疏水作用等次级键聚集,生物相容,传质性能好。生物相容,传质性能好。海藻酸+聚丙烯,聚乙烯亚胺-卡拉胶,硅胶-海藻酸钙聚合物纳米凝胶包埋辣根过聚合物纳米凝胶包埋辣根过氧化物酶,提高稳定性,保氧化物酶,提高稳定性,保持酶在有机溶剂中的活力持酶在有机溶剂中的活力纳
11、米载体纳米载体介孔磁性载体固定化微生物用于污水处理,COD去除率可达82.7%微胶囊(半透膜)微胶囊(半透膜)凝胶凝胶 Methods包埋(可溶形式)包埋(可溶形式)载体固定化载体固定化 交联交联 通过化学键与载体连接通过化学键与载体连接 吸附吸附 离子键结合离子键结合 配位结合配位结合 共价结合共价结合 (1)吸附法吸附法1916年年 Nellson&Griffin 木炭固定蔗糖酶木炭固定蔗糖酶简易,可逆性简易,可逆性载体重复使用载体重复使用避免化学修饰避免化学修饰保持酶活保持酶活酶吸附固定化的不同方法酶吸附固定化的不同方法离子吸附离子吸附生物特异性生物特异性非特异性非特异性配位配位疏水作用
12、疏水作用pH 7.07.5氨基酰化酶酶液氨基酰化酶酶液0.05mol/L NaOH,水洗涤,水洗涤 DEAE-Sephadex A251g/60mL酶液酶液冷库搅拌冷库搅拌吸附过夜吸附过夜 吸去上清液吸去上清液4备用备用水,醋酸钠溶液洗水,醋酸钠溶液洗涤固定化酶涤固定化酶活力回收:活力回收:50%60%;600800 mol/(h g)湿固定化酶湿固定化酶最早应用最早应用于工业化于工业化的固定化酶的固定化酶(2)共价法共价法A-活性氨基酸残基;活性氨基酸残基;B-载体上的官能团载体上的官能团C-载体;载体;D-间隔臂间隔臂酶与载体连接牢固,酶与载体连接牢固,稳定性高,但酶易失活稳定性高,但酶易
13、失活不同氨基酸残基的不同氨基酸残基的活性官能团活性官能团载体的结合官能团载体的结合官能团酶的结合官能团酶的结合官能团天然高分子载体天然高分子载体人工合成高聚物载体人工合成高聚物载体载体与酶的载体与酶的共价结合模式共价结合模式1 重氮化重氮化 2 叠氮化叠氮化3 烷基化和芳基化烷基化和芳基化4 溴化氰溴化氰 5 Schiff碱碱6 Ugi反应反应 7 酰胺化酰胺化8 巯基巯基-二硫键变换反应二硫键变换反应9 Mercury-酶相互作用酶相互作用10 氧化氧化 11 肽键肽键载体的结载体的结合官能团合官能团酶的结合酶的结合官能团官能团载体需载体需事先活化事先活化1-O-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果
14、糖酵母乳糖酶(100mg)溶于56mL磷酸缓冲液(pH7.Immobilization,Why?1 固定化的目的和定义与溶液酶相比,稳定性提高。原因:载体的空间位阻作用,大分子底物难于接近酶分子Hokkaido Sugar戊二醛(glutaraldehyde)与游离酶相比,固定化酶的最适温度一般变化不大,部分酶固定化后最适温度发生明显变化。Grace(USA)吸附孔径、比表面积、酶负载量的关系结晶与离子交换吸附法(Genencor公司)果葡糖浆:葡萄糖异构酶/木糖异构酶载体与酶的共价结合模式N,N-二甲基苯胺 800t6 Ugi反应 7 酰胺化既可作用于大分子底物,又可作用于小分子底物的酶,特
15、异性往往会发生变化。1g/60mL酶液2 固定化的载体和方法固定化方法:海藻酸钠交联包埋法重氮化反应重氮化反应举例:含举例:含-NH2载体载体与异硫氰酸反应与异硫氰酸反应酶中游离氨基、组氨酸咪唑基、酶中游离氨基、组氨酸咪唑基、酪氨酸的酚基参与反应酪氨酸的酚基参与反应用于固定酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶用于固定酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶举例:含举例:含-COOH载体载体,如如CMC酶中游离氨基酶中游离氨基参与反应参与反应与琥珀酰亚胺反应与琥珀酰亚胺反应与氯化亚砜反应与氯化亚砜反应举例:含举例:含-COOH载体载体,如如CMC与酶中游离氨基、与酶中游离氨基、巯
16、基、羟基、酚巯基、羟基、酚羟基反应羟基反应叠氮化反应叠氮化反应酯化酯化酰肼衍生物酰肼衍生物叠氮衍生物叠氮衍生物举例:含举例:含-OH载体载体,如多糖如多糖与酶中游离氨基、与酶中游离氨基、羟基反应羟基反应与溴化氰反应与溴化氰反应活泼的活泼的亚胺碳酸酯亚胺碳酸酯条件条件温和温和举例:含举例:含-OH载体载体,如多糖如多糖与酶中游离氨基、与酶中游离氨基、羟基、巯基反应羟基、巯基反应与三氯均三嗪反应与三氯均三嗪反应磺酰化反应磺酰化反应环氧化反应,如环氧化反应,如Eupergit 举例:含硅无机载体举例:含硅无机载体方法一:载体表面包覆有机层(如琼脂糖、葡聚糖、白蛋白),方法一:载体表面包覆有机层(如琼
17、脂糖、葡聚糖、白蛋白),或用表面聚合法或用表面聚合法“镀上镀上”一层聚合物,再对包覆后的表面活化一层聚合物,再对包覆后的表面活化方法二:利用有机硅试剂直接活化硅羟基方法二:利用有机硅试剂直接活化硅羟基蒸馏水蒸馏水 1mL,1mol/L HCl 1mL,5%NaNO2 1mLABSE-交联交联琼脂琼脂 3g 冰水浴,冰水浴,15min,洗去,洗去NO2-4备用备用1mol/L Na2CO3调节调节pH 7.0,冰水浴,冰水浴2hABSE-交联交联琼脂固定化碱琼脂固定化碱性磷酸酯酶性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶约碱性磷酸酯酶约300u,BSA 20mg,NaCl,MgSO4,ZnSO4溶液溶液重氮盐重氮盐
18、ABSE:对氨基苯磺酰乙基:对氨基苯磺酰乙基(3)包埋法包埋法不涉及化学修饰,条件不涉及化学修饰,条件温和,酶活力回收率高温和,酶活力回收率高凝胶包埋法:凝胶包埋法:酶分子包在高聚物格子中酶分子包在高聚物格子中i.天然凝胶包埋法天然凝胶包埋法海藻酸钠海藻酸钠+细胞细胞+酶酶CaClCaCl2 2溶液溶液其他天然凝胶:其他天然凝胶:明胶、明胶、琼脂凝胶、琼脂凝胶、卡拉胶等卡拉胶等喷射切割器喷射切割器注射方法得注射方法得藻酸盐球珠藻酸盐球珠喷射切割器喷射切割器 得得藻酸盐球珠藻酸盐球珠水,醋酸钠溶液洗涤固定化酶丙烯酰胺单体 1530%微胶囊材料:聚酰胺膜、火棉胶膜等带负电载体:最适 pH 聚电解质
19、络合法:如海藻酸钠与聚赖氨酸通过静电作用结合。细胞交联法(Novo公司)带负电载体:最适 pH Corning(USA)6-氨基青霉烷酸(6-APA):N,N-二甲基苯胺 800tAl2Mg3Si4H2O12coli悬浮于2L 0.基于Eupergit载体BIS:N,N-亚甲基双丙烯酰胺;9 Mercury-酶相互作用该图中随孔径增大,酶所占据的内表面积越小,酶负载量越小。Carrier properties例2:色氨酸酶与载体共价结合之后,最适温度比游离酶高 515摄氏度。ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋 网格型网格型
20、丙烯酰胺丙烯酰胺 BIS BIS:N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺 1.酶酶2.单体单体+交联剂交联剂3.起始剂起始剂4.搅拌分散搅拌分散1.酵母乳糖酶酵母乳糖酶(100mg)溶)溶于于56mL磷酸缓磷酸缓冲液(冲液(pH7.3)2.丙烯酰胺单丙烯酰胺单体体 1530%BIS交联剂交联剂5%3.起始剂:起始剂:0.6mL TEMED,200mg过硫过硫酸铵缓冲液酸铵缓冲液4.1mL 失水失水山梨醇半油酸山梨醇半油酸酯,酯,400mL甲甲苯苯-氯仿氯仿固定化酶颗粒固定化酶颗粒 100200m珠状聚丙烯酰胺包埋珠状聚丙烯酰胺包埋-半乳糖苷酶半乳糖苷酶ii.聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶
21、包埋法氮气,氮气,4,30minBIS:N,N-亚甲基双丙烯酰胺;亚甲基双丙烯酰胺;TEMED:四甲基乙二胺:四甲基乙二胺搅拌分散搅拌分散1.酶酶2.单体单体+交联剂交联剂3.起始剂起始剂1.1kg 湿重湿重E.coli悬浮于悬浮于2L 0.9%NaCl,82.丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体 750g,BIS交联交联剂剂2.4L,8聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌(天冬氨酸酶)(天冬氨酸酶)3.100mL-二甲基氨基丙腈,二甲基氨基丙腈,500mL,1%过硫酸钾(起始剂)过硫酸钾(起始剂)2025到到30时冰水时冰水迅速冷却迅速冷却凝胶切成凝胶切成34mm3的立方体的立方体ii.聚丙烯酰
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