特殊毒性试验培训课件.pptx

1、研究对遗传物质是否有损伤，是否会引起肿瘤、研究对遗传物质是否有损伤，是否会引起肿瘤、衰老及畸胎等衰老及畸胎等目的和意义：特点：特殊毒性试验存在着种属差异性：特殊毒性试验存在着种属差异性：定性差异定性差异定量差异定量差异定性差异定性差异 反应停对家兔和种灵长类动物致畸，但至少反应停对家兔和种灵长类动物致畸，但至少对对10种品系大鼠、种品系大鼠、15种品系小鼠、种品系小鼠、2种家狗、种家狗、种田鼠和种灵长类动物不致畸种田鼠和种灵长类动物不致畸 可的松对兔子和小鼠强力致畸，但对大鼠不致可的松对兔子和小鼠强力致畸，但对大鼠不致畸畸 硫唑嘌呤对大鼠不致畸，但对兔子强致畸硫唑嘌呤对大鼠不致畸，但对兔子强致

2、畸 氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但对兔子却氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但对兔子却引起脸和内脏畸形引起脸和内脏畸形 定量差异定量差异致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显 表表 人类与动物致畸剂量比较人类与动物致畸剂量比较 药物药物 最低致畸剂量（最低致畸剂量（/kg/d)人与动物比值人与动物比值 人人 动动 物物反应停反应停 0.5-1.0mg 兔兔 2.5mg 5-2.5 氨基喋呤氨基喋呤 50g 大鼠大鼠 100g 2 氨甲喋呤氨甲喋呤 42g 大鼠大鼠 200g 4.8 乙烯雌酚乙烯雌酚 20-80g 恒河猴恒河猴 200g 10-2.5 苯

3、妥英钠苯妥英钠 2mg 小鼠小鼠 50mg 25内容：n 遗传毒性遗传毒性n 致癌作用致癌作用n 生殖和发育毒性生殖和发育毒性n 药物依赖性药物依赖性遗传毒性研究（遗传毒性研究（Genotoxicity Study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。遗传毒性试验：遗传毒性试验：指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检出试物的体

4、外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤损伤及其损伤的固定的固定。遗传毒性试验的用途：遗传毒性试验的用途：主要用于致癌性预测。主要用于致癌性预测。遗传毒性试验的目的：遗传毒性试验的目的：预测受试物是否有遗传毒性，降低临床试验受试者和药品预测受试物是否有遗传毒性，降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险。上市后使用人群的用药风险。药物的遗传毒性研究 遗传毒性和致突变：遗传毒性和致突变：联系、区别联系、区别药物的遗传毒性研究目前，遗传毒性试验方法较多，所使用的生物材料多种多样，可以利用原核细胞到真核细胞直至高等哺乳动物细胞在体外进行添加或不添加代谢活化物质的试验，也可在整体动物上进行

5、体内试验根据根据试验检测的遗传终点试验检测的遗传终点可将检测方法分为三大类可将检测方法分为三大类:基因突变染色体畸变DNA损伤与修复从从试验系统试验系统来分来分:体内试验体外试验分类：微生物回复突变试验微生物回复突变试验 基因突变基因突变 哺乳动物培养细胞基因突变试验哺乳动物培养细胞基因突变试验 果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐性致死试验 哺乳动物培养细胞染色体畸变试验哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 染色体畸变染色体畸变 啮齿类动物微核试验啮齿类动物微核试验 啮齿类动物显性致死试验啮齿类动物显性致死试验 精原细胞染色体畸变试验精原细胞染色体畸变试验 程序外程序外DNA合成试验合成试验 DNA损伤

6、与修复损伤与修复 姐妹染色单体交换试验姐妹染色单体交换试验 SOS显色试验显色试验 检测终点检测终点药物的遗传毒性研究（1）一项一项体外细菌基因突变试验体外细菌基因突变试验。（2）一项用）一项用哺乳动物细胞进行的体外染色体损伤评哺乳动物细胞进行的体外染色体损伤评估估试验或体外小鼠淋巴瘤试验或体外小鼠淋巴瘤tk试验。试验。（3）一项用）一项用啮齿类动物造血细胞进行的体内染色体啮齿类动物造血细胞进行的体内染色体损伤试验损伤试验。原理原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而

7、能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。S9混合液混合液：微生物回复突变试验微生物回复突变试验1.2坚守工作岗位，注意监视压力、温度、流量，做到设备不超压、不超载运行。23.投标文件的密封与标记3.1经评标委员会评议认定有下列情形之一的，属于投标人相互串通投标：3、专职团干部和在岗兼职团(总)支部正副书记。6.2做好加气前的检查工作，及时发现充装过程中的潜在危险，对有隐患车辆不允许加气。1仪表【本讲小结】3.3安全附件应经常检查，确保合格。按国家规定进行专门的安全技术培训考核，取得特种作业操

8、作资格证后方可上岗作业；4.5.1本单位的生产概况，安全卫生状况；27.1 卖方未经买方事先书面同意，不得将合同、合同中的条款或由买方或以买方名义提供的任何规范、规划、图纸、模型、样品或资料提供给与履行本合同无关的任何人。5.4新从业人员的安全培训考核：7.2 月报：生产月报于每月1日上午书面报生产部，生产部每月1日下午将相关报表报给分管领导、及各部门；能源（包括电力、柴油、原材料等）消耗与库存月报于每月2日12：00前报生产部；劳动工资月报及主要经济指标月报于每月10日前报生产部。生产部按公司及统计局规定时间按期报出。（突变型）（突变型）（野生型）（野生型）正向突变正向突变回复突变回复突变受

9、试物受试物S9混合物混合物鼠伤寒沙门菌鼠伤寒沙门菌His+鼠伤寒沙门菌鼠伤寒沙门菌His 试验菌株：试验菌株：TA97、TA98、TA100和和TA102 剂量设计：剂量设计：（1）受试物至少应有）受试物至少应有5个剂量。个剂量。（2）最低剂量：）最低剂量：1 g/皿或皿或0.1 g/皿皿（3）最高剂量：）最高剂量：可溶、无毒：可溶、无毒：5mg/皿皿 可溶、有毒：显示明显毒性，但不超过可溶、有毒：显示明显毒性，但不超过5mg/皿皿 难溶、无毒：产生沉淀的最低浓度，但不超过难溶、无毒：产生沉淀的最低浓度，但不超过5mg/皿皿 难溶、有毒：多个产生沉淀的浓度，显示明显毒性，不超过难溶、有毒：多个

10、产生沉淀的浓度，显示明显毒性，不超过5mg/皿皿 对照设置对照设置 溶剂溶剂阴性对照阴性对照 （DMSO或者乙醇）或者乙醇）已知致突变原已知致突变原阳性对照阳性对照 菌株鉴定菌株鉴定 组氨酸营养缺陷鉴定组氨酸营养缺陷鉴定 深粗糙型鉴定深粗糙型鉴定 uvrB缺失的鉴定缺失的鉴定 R因子鉴定因子鉴定 肝微粒体酶肝微粒体酶S9代谢活化代谢活化系统：系统：（1）S9诱导：诱导：多氯联苯多氯联苯 500mg/kg 大鼠大鼠ip.（2）S9的制备的制备:低温无菌条件制备肝匀浆低温无菌条件制备肝匀浆 4，9000g，离心，离心10min 上清即为上清即为S9。（3）S9混合液：混合液：平衡盐系统，其中含平衡

11、盐系统，其中含S9 530（v/v）（标准平皿掺入法）（标准平皿掺入法）：顶层琼脂测试菌株、顶层琼脂测试菌株、受试物、受试物、S9混合液混合液底层琼脂培养基平皿底层琼脂培养基平皿固化固化37，培养，培养48h菌落计数菌落计数 结果评价：结果评价：Rt/Rc2，并有量效关系，判为阳性；，并有量效关系，判为阳性；滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落。滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落。试验方法试验方法（点试法）：（点试法）：细胞细胞:CHL、CHO、人外周血淋巴细胞等。、人外周血淋巴细胞等。建议首选建议首选中国仓鼠肺细胞中国仓鼠肺细胞(CHL),需定期检查核型和有无支原需定期检查核型和有无支原体等污染。

12、体等污染。-80或液氮冻存或液氮冻存剂量：剂量：高剂量高剂量以以50细胞生长抑制浓度为基准细胞生长抑制浓度为基准，最高不要超过，最高不要超过10mM分子量。溶解受限时可采用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释分子量。溶解受限时可采用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释法。至少个剂量法。至少个剂量对照：对照：阴性对照阴性对照溶剂溶剂 阳性对照阳性对照已知致突变剂已知致突变剂对照对照:代谢活化：代谢活化：肝微粒体酶肝微粒体酶S9系统系统,应用诱导剂处理应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微粒体酶（后的哺乳动物肝微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验）进行体外代谢活化试验时间：时间：药物作用时间药物作用时间:药物和细胞接触非

13、活化组作用药物和细胞接触非活化组作用24h和和48h收获细胞收获细胞,代谢活化组作用代谢活化组作用6小时以上小时以上标本制作时间：药物和细胞接触后起算，分别在标本制作时间：药物和细胞接触后起算，分别在24h和和48h收获细胞（收获细胞（在在1.5个细胞周期时收获细胞，若为阴性结果，作用时个细胞周期时收获细胞，若为阴性结果，作用时间可大于间可大于1.5个细胞周期个细胞周期)（2）读片分析：）读片分析：每种浓度至少观察每种浓度至少观察100个中期分裂相个中期分裂相，在油镜下分别记录染色，在油镜下分别记录染色体的结构畸变，多倍体以及畸变细胞数和畸变类型体的结构畸变，多倍体以及畸变细胞数和畸变类型包括

14、：染色体有无断裂、缺失、互换和裂隙包括：染色体有无断裂、缺失、互换和裂隙 多倍体的出现多倍体的出现 结果判定：结果判定：细胞畸变率有染色体畸变的细胞数细胞畸变率有染色体畸变的细胞数/分析染色体的细胞总数分析染色体的细胞总数100 细胞畸变率细胞畸变率 结果判断结果判断 5 阴性（）阴性（）510 可疑（可疑（）1020 弱阳性（）弱阳性（）2050 中度阳性（）中度阳性（）50 强阳性（）强阳性（）注意：遇阳性或可疑阳性时，可选啮齿动物显性致死试验或精原细胞染色体畸变试验注意：遇阳性或可疑阳性时，可选啮齿动物显性致死试验或精原细胞染色体畸变试验3招待会议室入座的服务礼仪2心理性的满足在动态培训

15、的过程中，学员应该主动、积极、热忱、开放，服务的时候充满自信，要让对方感到满意，掌握使顾客满意的标准，那么培训就取得效果了。这些方法都可以带动服务人员具体服务水平的提高。11检验和验收作业现场经常可看到主管为故障的事后处理而烦恼，实际上这此故障只要通过几分钟的事前预防即可防止，却因作业人员视若无睹而造成大故障，例如：机械的给油量不足、油内混入异物造成管路阻塞、螺丝未能锁紧等等。这些微缺陷之所以造成故障，是因为当时不排除不至于立刻产生异常，因此谁都认为不重要。微缺陷的排除只有彻底活用5S手法才能真正解决问题。3.5 当班调度有权根据品质要求对原燃材料、半成品、成品库存进行调配，对公司的物流流量负

16、责，对生产物料平衡负责。2)取消该剩下的货物，并按双方商定的金额向卖方支付部分完成的货物和服务以及卖方以前已采购的材料和部件的费用。11.2 货物的数量不足或表面瑕疵，买方应在验收时当面提出；对其它质量问题有异议的应在安装调试后七(7)天内提出。运用媒体的传播力量，进一步刺激台湾银行员工产生荣誉感，同时也在社会上形成很高的期待。这种期待又进一步要求银行改进服务，这种相互需求和相互改进，形成一个良性的循环。运用这种方式从内在、外在两个方面把企业进行了整体的改造。租户对智能化系统必然有一个接受及熟悉的过程，在这一过程中，各种误操作都会随时出现，造成智能中心的报警频繁发生，所以区分并处理好这种误报警

17、是管理好这一套智能系统的关键，我们将根据实际情况，在入住初期设定一个N秒的滞后报警（由软件实现），当住户误操作时，可在N秒内通过室内的操作键盘，解除报警，这样智能中心就不会发出报警信号，从而有效地解决了初期频繁误报警的问题。（1）对工作进行量化、细化、管理、监控。1情景体验的方法尤其令人惊讶的是，参观团的一个成员看到：后面还有一个工人装束的人在鞠躬。这是一位接近退休年纪的老先生。此时所有的代表团成员都在跟工厂的领导道别，这一切本来与这位老先生无关，可是他依然以厂为家，以公司为荣，用一样的礼仪欢送贵宾离开。正常染色体正常染色体畸变染色体畸变染色体微核（Micronucleus）：染色单体或染色体

18、的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。原理原理:染色体畸变导致断裂染色体畸变导致断裂 子代细胞主核之外的一个或多个颗粒（微核）子代细胞主核之外的一个或多个颗粒（微核）骨髓嗜多染红细胞：无核，易于鉴别微核骨髓嗜多染红细胞：无核，易于鉴别微核 动物：动物：小鼠小鼠，至少至少6只只/组组 各各 5只只/组组 给药剂量及途径：给药剂量及途径：3个剂量，高剂量个剂量，高剂量LD50/2 与临床拟用给药途径相同，一般单次给药。与临床拟用给药途径相同，一般单次给药。对照：阴

19、性对照对照：阴性对照溶剂溶剂 阳性对照阳性对照如环磷酰胺如环磷酰胺 骨髓采样：给药后骨髓采样：给药后1272h内内 5个时间点个时间点 若无差别，给药后若无差别，给药后24h 涂片制备涂片制备:涂片涂片 固定固定 染色染色 封片封片 镜检：镜检：判定：判定：1.受试物所诱发的微核率的增加与剂量相关2.某一测试点微核增加可重复并有统计学意义符合上述一条即可判为阳性 注意：注意：1.对Giemsa染色中获得可疑阳性或弱阳性结果的药物，必须用荧光染色以进一步肯定或否定阳性结果 2.不易通过骨髓屏障的药物，可补充用哺乳动物胎肝细胞微核试验进一步研究 3.如遇阳性或可疑阳性时，可选择UDS试验或SOS显

20、色试验内容：n 遗传毒性遗传毒性n 致癌作用致癌作用n 生殖和发育毒性生殖和发育毒性n 药物依赖性药物依赖性致癌试验的目的致癌试验的目的是考察药物在动物体内的潜在致癌作用，从而评价和预测其可能对人造成的危害。由于致癌试验耗费大量时间和动物资源，只有当确实需要通过动物长期给药研究评价人体中药物暴露所致的潜在致癌性时，才应进行致癌试验。任何体外实验、动物毒性试验和人体应用中出现的潜在致癌性因素均可提示是否需要进行致癌试验。动物致癌试验的结果与人体的相关性仍然存在一些争议，作用机制的研究对评价动物出现的肿瘤与人体的相关性是有价值的。当动物致癌试验出现阳性结果时，可能需要做进一步的研究，探讨其作用机制

21、，以帮助确定是否存在对人体的潜在致癌作用。历史背景历史背景 在日本，根据1990年“药物毒性研究指导原则手册”，如果临床预期连续用药6个月或更长时间，则需要进行致癌试验。尽管连续用药少于6个月，如果存在潜在致癌性因素，也可能需要进行致癌试验。在美国，大多数药物在广泛应用于人体之前，已进行了动物致癌试验。根据美国药品食品监督管理局（FDA）要求，一般药物使用3个月或更长时间，需要进行致癌试验。在欧洲，“欧共体药品管理条例”规定了需要进行致癌试验的情况，包括长期应用的药物，即至少6个月的连续用药，或频繁的间歇性用药以致总的暴露量与前者相似的药物。自2005以来，我国药品注册管理办法附件中规定预期临

22、床连续用药6个月以上或需经常间歇使用的药物应进行致癌试验，并指出了进行致癌试验的多个考虑因素。2007年1月国家食品药品监督管理局药品审评中心发布的治疗用生物制品非临床安全性技术审评一般原则中阐述了相关产品致癌试验的要求。2009年10月药品审评中心组织毒理专家、企业和研究单位代表召开了制定“药物致癌试验必要性技术指导原则”专题讨论会，会上基本认同了ICHS1A中内容的适用性，并结合国内情况进行了一些调整。为指导药物研究开发，国家食品药品监管局日前印发了药药物致癌试验必要性的技术指导原则物致癌试验必要性的技术指导原则。指导原则阐述了何种情况下需要进行药物致癌试验，以避免实验动物资源、人力资源和

23、物力资源的不必要使用。致癌试验的指导性文件致癌试验的指导性文件 指导原则适用于药品注册管理办法中的相关化学药，其基本原则也适用于中药、天然药物和生物制品。p 提出预期临床用药期至少连续临床用药期至少连续6个月的药物个月的药物p某些药物存在潜在致癌存在潜在致癌的担忧因素p当抗肿瘤药物拟用于非带瘤患者非带瘤患者的辅助治疗或非肿瘤适应非肿瘤适应证长期使用证长期使用时适用受试物适用受试物p对于化合物改盐、改酸根或碱基的情况，若已有原化合物致癌试验数据，应提供其与原化合物比较的药代动力学、药效学或毒性等方面无明显改变的证据。p当药物暴露量和毒性发生变化时，可能需进行桥接研究来确定是否需要进行新的致癌试验

24、。p对于酯类和络合衍生物，上述类似数据对考虑是否需进行新的致癌试验是有价值的，应根据具体情况具体分析。潜在致癌因素潜在致癌因素 如果某些药物存在潜在致癌的担忧因素，可能需要进行致癌试验。应慎重评价这些潜在致癌因素，因为这是大多数药物进行致癌试验的最主要理由。应考虑的几个因素包括：（1）已有证据显示此类药物具有与人类相关的潜在致癌性；（2）其构效关系提示致癌的风险；（3）重复给药毒性试验中有癌前病变的证据；（4）导致局部组织反应或其它病理生理变化的化合物或其代谢产物在组织内长期滞留。空间服务的满足5.3增压前的天然气管道宜埋地敷设，其管顶距地面不应小于0.5m。冰冻地区宜敷设在冰冻线以下。（2）

25、不同投标人委托同一单位或者个人办理投标事宜；4.4做好维护保养工作，防止腐蚀，定期送检。3三工并存、动态转换26.4 投标人所提交的投标文件在评标结束后无论中标与否都不退还，留招标公司存档。26.3 投标截止时间之后投标人不得撤回投标，否则其投标保证金将按本须知20.6条的规定不予退还。26.4 投标人所提交的投标文件在评标结束后无论中标与否都不退还，留招标公司存档。5.1 统计方法选定的目的和原则4.2.5事故现场的勘查技术以及应急处理措施；【案例】5.3充装工作期间必须穿戴劳保防护用品。p用于晚期全身肿瘤的抗肿瘤药物，通常不需要进行致癌试验。p对于替代治疗的内源性物质（浓度在生理水平），尤

26、其是当同类产品（如动物胰岛素、垂体来源的生长激素和降钙素）已有临床使用经验时，通常不需要进行致癌试验p系统暴露量非常小的局部用药不需要以经口给药途径来评价其对内脏器官的潜在致癌作用，若有潜在光致癌性担忧，可能需要进行皮肤给药致癌试验。p除非有明显的全身暴露或相关担忧，经眼给予的药物通常不需要进行致癌试验p有致癌潜在，但是短期接触或非经常使用药物（麻醉/放射）p经化学合成、从动物或人体组织中提取纯化或生物技术方法（如重组DNA技术）生产的内源性肽类或蛋白质及其类似物，可能需要特殊考虑。不适用受试物不适用受试物内源性多肽、蛋白质及其类似物在下述情况下可能仍需要进行长期致癌性评价：1）其生物活性与天

27、然物质明显不同；2）与天然物质比较显示修饰后结构发生明显改变。3）药物的暴露量超过了血液或组织中的正常水平。给药途径给药途径l尽可能与临床拟用途径一致l如果不同给药途径下代谢及系统暴露量相似，可采用其中一种给药途径开展致癌试验。（重点关注部位）时间安排时间安排l指导原则明确，当需要进行致癌试验时，通常应在申请上市前完成。l若对患者人群存在特殊担忧，在进行大样本临床试验之前需完成啮齿类动物的致癌试验。l对于开发用于治疗某些严重疾病（如艾滋病）的药物，申请上市前可不必进行动物致癌试验，但在上市后应进行这些试验。药物致癌作用的评价致癌作用的评价方法：致癌作用的评价方法：致突变试验致突变试验 哺乳动物

28、培养细胞恶性转化试验哺乳动物培养细胞恶性转化试验 彗星试验彗星试验 哺乳动物短期哺乳动物短期/长期致癌试验长期致癌试验 短期短期 转基因动物模型转基因动物模型小鼠肺肿瘤诱发试验小鼠肺肿瘤诱发试验大鼠肝转变灶诱发试验大鼠肝转变灶诱发试验小鼠皮肤肿瘤诱发试验小鼠皮肤肿瘤诱发试验雌性大鼠乳腺癌诱发试验雌性大鼠乳腺癌诱发试验小鼠肺肿瘤诱发试验小鼠肺肿瘤诱发试验大鼠肝转变灶诱发试验大鼠肝转变灶诱发试验小鼠皮肤肿瘤诱发试验小鼠皮肤肿瘤诱发试验雌性大鼠乳腺癌诱发试验雌性大鼠乳腺癌诱发试验 动物：幼年小、大鼠，各半。每组动物：幼年小、大鼠，各半。每组只只 剂量：剂量：个，低剂量个，低剂量-ACD，其余剂量可根

29、，其余剂量可根据药理毒理作用等因素综合考虑据药理毒理作用等因素综合考虑 对照：空白、溶媒或赋形剂对照。对照：空白、溶媒或赋形剂对照。实验期限：大鼠实验期限：大鼠年，小鼠年，小鼠1.5年。年。给药途径：同临床拟用途径给药途径：同临床拟用途径 观察与检查：观察记录一般情况，肉眼观察到肿观察与检查：观察记录一般情况，肉眼观察到肿瘤病变时，取各器官系统做病检瘤病变时，取各器官系统做病检 评定：根据各组肿瘤发生率、潜伏期和多发性等评定：根据各组肿瘤发生率、潜伏期和多发性等做出全面的科学评价做出全面的科学评价培养细胞恶性转化试验 细胞细胞:SHE 给药剂量：给药剂量：至少至少3个剂量，高剂量为个剂量，高剂

30、量为50细胞生长受抑剂量。细胞生长受抑剂量。药物作用时间药物作用时间：受试药与细胞接触受试药与细胞接触24h 更换培养基后再培养更换培养基后再培养714d 对照：对照：阴性对照阴性对照溶剂溶剂 阳性对照阳性对照已知致癌物已知致癌物 转化集落转化集落细胞密集堆积，周围交叉排列细胞密集堆积，周围交叉排列集落中有圆形细胞，外围少数交叉集落中有圆形细胞，外围少数交叉整个集落均可见交叉排列和重叠生长整个集落均可见交叉排列和重叠生长 镜检：镜检：培养细胞恶性转化试验 结果判断结果判断:集落转化率（）转化集落数集落转化率（）转化集落数/集落总数集落总数100 符合下述一条者判为阳性：符合下述一条者判为阳性：

31、（1）集落转化率有明确的量效关系；）集落转化率有明确的量效关系；（2）若无量效关系，但在）若无量效关系，但在2个或个或2个以上的剂量发生恶性转化；个以上的剂量发生恶性转化；（3）在单一剂量下出现）在单一剂量下出现3个或个或3个以上的转化集落。个以上的转化集落。单细胞凝胶电泳：单细胞凝胶电泳：“彗星试验彗星试验”肿瘤发生率肿瘤发生率肿瘤的发生率是整个实验终了时患瘤动物总数在有效动物总数中所占的百分率。有效动物总数指最早出现肿瘤时的存活动物总数。实验终了时患瘤动物总数 肿瘤发生率=100 有效动物总数诱癌试验阳性的判断标准诱癌试验阳性的判断标准采用结合国世界卫生组织提出的四条判断诱癌试验阳性的标准

32、：肿瘤只发生在试验组动物中，对照组无肿瘤；试验组与对照组动物均发生肿瘤，但试验组中发生率高；试验组动物中多发性肿瘤明显，对照组中无多发性或只少数动物有多发性肿瘤；试验组与对照组动物肿瘤的发生率无显著性差异，但试验组中肿瘤发生的时间较早。上述四条中，试验组与对照组之间的数据经统计学处理后任何一条有显著性差异即可认为检品的诱癌试验阳性。诱癌试验阴性结果的确立诱癌试验阴性结果的确立假如动物实验的规模为两种种属、两种性别，至少3个剂量水平，其中一个接近最大耐受剂量，每组动物数至少50只，实验组肿瘤发生率与对照组无差异，才算阴性结果。致癌性试验的期限必须包括受试物正常生命期的致癌性试验的期限必须包括受试

33、物正常生命期的大部分时间：大部分时间：确定试验期限的几条准则：（1）一般情况下，试验结束时间对小鼠和仓鼠应在18个月，大鼠在24个月；然而对某些生命期较长的或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可在24个月，大鼠可在30个月。（2）当最低剂量和对照组存活动物只有25%时，也可以结束试验。对于有明显性别差异的试验，则其结束的时间对不同的性别应有所不同。在某种情况下因明显的毒性作用只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。两个物种两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为有致癌性。两个物种两种性别动物试验结果均为阴性时，方能认为未观察到致癌作用。内容：n 遗传毒性遗传毒性n 致癌作用致癌作用n 生

34、殖和发育毒性生殖和发育毒性n 药物依赖性药物依赖性生殖毒性研究生殖毒性研究（Reproductive toxicity study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与急性毒性、长期毒性、遗传毒性等毒理学研究有着密切的联系，是药物进入临床研究及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行生殖毒性试验。在药物开发的过程中，生殖毒性研究的目的是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。生殖毒性研究在限定临床研究受试者范围、

35、降低临床研究受试者和药品上市后使 用 人 群 的 用 药 风 险 方 面 发 挥 重 要 作 用。生殖毒性和发育毒性评价生殖毒性和发育毒性评价 外源化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、外源化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害。外源化学物对胚胎发育和出生幼仔发育外源化学物对胚胎发育和出生幼仔发育的影响。的影响。可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段：可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段：A.从交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精）。B.从受孕到着床（成年雌性生殖功能、着床前发育、着床）。C

36、.从着床到硬腭闭合（成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成）。D.从硬腭闭合到妊娠终止（成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长）。E.从出生到离乳（成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长）。F.从离乳到性成熟（离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）。（1）一般生殖毒性试验一般生殖毒性试验：生殖过程的第一阶段生殖过程的第一阶段 目的：检测药物对生殖腺、性周期、交配能力、受孕率和胚胎早期发目的：检测药物对生殖腺、性周期、交配能力、受孕率和胚胎早期发育阶段的影响。育阶段的影响。（2）致畸敏感期致畸敏感期毒性试验：毒性试验：生殖过程的第二阶段生殖过程的

37、第二阶段 目的：确定药物是否具有胚胎毒性或致畸性。目的：确定药物是否具有胚胎毒性或致畸性。（3）围生期围生期毒性试验：毒性试验：生殖过程的第三阶段生殖过程的第三阶段 目的：检测药物对胚胎发育后期、母体妊娠、分娩过程、哺乳和幼仔目的：检测药物对胚胎发育后期、母体妊娠、分娩过程、哺乳和幼仔在新生期存活和生长发育的影响。在新生期存活和生长发育的影响。一般生殖毒性评价内容包括配子成熟度、交配行为、生育力、胚胎着床前阶段和着床等。对于雌性动物，应对动情周期、受精卵输卵管转运（tubal transport）、着床及胚胎着床前发育的影响进行检查。生育力与早期胚胎发育 胚胎-胎仔发育毒性试验 妊娠动物自胚胎

38、着床至硬腭闭合给药，评价药物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响。评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、胚胎胎仔死亡、生长改变和结构变化等 致畸敏感期毒性试验 动物动物:首选大鼠，也可用小鼠和家兔首选大鼠，也可用小鼠和家兔 大小鼠大小鼠20只只/组，家兔组，家兔10只只/组组 剂量：剂量：至少至少3个剂量个剂量 最高剂量，可引起母体轻度中毒，但死亡不超过最高剂量，可引起母体轻度中毒，但死亡不超过10 最低剂量，不引起毒性反应最低剂量，不引起毒性反应 对照：对照：阴性对照阴性对照溶剂溶剂 阳性对照阳性对照已知致畸物已知致畸物 给药途径：给药途径：与临床拟用给药途径相同，注：不宜与临床拟用给

39、药途径相同，注：不宜ip.给药时期：给药时期：大、小鼠孕后大、小鼠孕后615天，家兔天，家兔618天天 动物交配：动物交配：雌雄雌雄1:1或或2:1同笼交配同笼交配 出现阴道栓出现阴道栓受孕受孕0日日致畸敏感期毒性试验 观察和检查观察和检查:（1）体重：大鼠妊娠第）体重：大鼠妊娠第0、3、7、10、13、16、20天天（2）胎仔检查：自然分娩前）胎仔检查：自然分娩前12日日 黄体数、活胎数、活胎重、死胎数等黄体数、活胎数、活胎重、死胎数等 活胎进行畸形检查活胎进行畸形检查（3）生理、生化、神经功能异常：）生理、生化、神经功能异常：1/4孕鼠孕鼠 自然分娩自然分娩 观察出生幼仔至断奶观察出生幼仔

40、至断奶 结果判定：结果判定：（1）活产幼仔平均畸形出现数畸形总数）活产幼仔平均畸形出现数畸形总数/活产幼仔数活产幼仔数（2）畸胎出现率出现畸形的胎仔总数）畸胎出现率出现畸形的胎仔总数/活产胎仔总数活产胎仔总数100（3）母体畸胎出现率出现畸胎的母体数）母体畸胎出现率出现畸胎的母体数/妊娠母体数妊娠母体数100围产期毒性试验 动物：小鼠或大鼠每组只孕鼠，家兔每组只孕兔。给药时期：妊娠后期及整个泌乳期。检查：所有雌性动物自然分娩，观察下一代直至成年检查其新生后存活、生长和发展情况，其中包括行为、生殖功能及其它异常症状。必要时还可对给药的雌性动物长期观察其生殖、受孕、分娩及次子代的情况。所有动物种属

41、都有其不足之处，例如：所有动物种属都有其不足之处，例如：大鼠：对性激素敏感；不适合用于多巴胺受体激动剂的研究，因其早期妊娠的发生和维持所依赖的激素主要是催乳素；妊娠后期对非甾体抗炎药高度敏感。小鼠：代谢率高，易惊、群体畸形现象（所有种属动物均会出现）特别明显，胎仔小。家兔：常缺乏药代动力学和毒理资料，对一些抗生素和消化道功能紊乱敏感，临床表现的解释较困难。豚鼠：常缺乏药代动力学和毒理资料，对一些抗生素和消化道功能紊乱敏感，胎仔发育期长，历史背景资料不足。家猪和/或小型猪：群体畸形的背景情况多变,所需的受试物量大，需要较大饲养空间，历史背景资料不足。白鼬：如果不采用特殊的管理系统，只能季节性繁殖

42、（其成功与否主要取决于人和动物的相互影响），历史背景资料不足。仓鼠：静脉给药虽非不可能，但相当困难，会将受试物存于颊部小囊中而影响实际给药量，攻击性非常强，对肠道功能紊乱敏感，对许多受试物有过度敏感的致畸反应，胎仔小。犬：季节性繁殖，多近亲繁殖，历史背景资料不足。非人灵长类动物：与其他种属动物一样，其药代动力学情况与人不同，历史背景资料不足，常常因为其只数太少而难以进行危险性评估。更适合用于进行明确生殖毒性物质（该毒性已比较肯定）特性的试验研究，而不是评估其危险性。目前要求生育力与早期胚胎发育毒性试验和胚胎-胎仔发育毒性试验在临床试验开始前完成。在某些特殊情况下，如用于艾滋病、晚期恶性肿瘤等治

43、疗的药物以及用于生殖控制、孕妇等特殊人群的药物，可灵活考虑生殖毒性的要求，如研究内容和具体设计、动物种属和阶段性等 内容：n 遗传毒性遗传毒性n 致癌作用致癌作用n 生殖和发育毒性生殖和发育毒性n 药物依赖性药物依赖性药物依赖性试验按毒品来源分类：（1）天然毒品，如鸦片、吗啡，可卡因、古柯叶，大麻，麦司卡林，致幻蘑菇菌等。（2）化学合成毒品，如海洛因，苯丙胺类毒品，致幻剂LSD等。、按毒品对人体的作用分类：（1）中枢神经镇静型，如鸦片、吗啡、海洛因、安定类、巴比妥类。（2）中枢神经兴奋型，如可卡因、苯丙胺类毒品。（3）致幻型，如LSD、麦司卡林。（4）综合作用型，如大麻。（1）巴比妥类镇静催眠

44、药：）巴比妥类镇静催眠药：这类药物在上世纪初即用于临床，使用不久，人们就发现其有较强的成瘾性。由于容易产生耐受性，不少病人逐渐增大剂量，日久便对其产生了依赖，有时在一次大剂量服用后即可以成瘾。这类药物的代表品种有戊巴比妥、司可巴比妥、阿米妥等，目前临床上已基本不再使用。（2）非巴比妥类镇静催眠药：）非巴比妥类镇静催眠药：巴比妥类药有较强的成瘾性，面对众多的失眠症患者，医药学家只得另辟蹊径，开发替代产品，上世纪中叶，导眠能、眠尔通、安眠酮等相继问世，但问世不久即有报道，这些药仍无法解决成瘾问题，于时它们也渐渐被逐出了市场。（3）苯二氮蕞类抗焦虑药：）苯二氮蕞类抗焦虑药：这是一类具有良好抗焦虑作用

45、及催眠作用的药物，且副作用不小，故目前在临床上得到广泛使用，苯二氮蕞类药成瘾性较小，但如果长期或大量使用，该类药也会产生依赖现象。（4）非麻醉性镇痛药：）非麻醉性镇痛药：这类药的主要品种阿司匹林、安乃近、氨基比林、非那西丁等。这些临床上使用极广的药物，具有退热和减轻躯体某些疼痛的作用，但有不少人将此药用以提神或解脱心理压力，一些有慢性疼痛的人更是长年累月地使用这类药物，结果形成了药物依赖。除了上述的一些药容易成瘾之外，中枢兴奋剂中的苯丙胺（摇头丸）及吗啡类中的咖啡因、可待因等都有极强的成瘾性，这些药品都在政府的严格控制之列。身体依赖性试验-自然戒断试验 连续给药后突然停药，观察戒断症状，与同类

46、的代表药作对比，判断受试药的依赖性潜力 动物：小、大鼠和猴。小鼠体重20-24g，每组20只，大鼠体重180-220g，每组10只,猴体重3-5kg，每组35只，各半 剂量：23，须设赋形剂对照和阳性药对照(吗啡，苯巴比妥或巴比妥)。低剂量用ACD；高剂量组依赖性潜力低的药物应选用接近毒性反应的剂量，毒性低的药物选用MTD。药物可采用恒量或剂量递增的方式给予身体依赖性试验-自然戒断试验 给药途径：12种给药途径，必须有一种与临床用药途径相同 给药期限：镇痛药在小、大鼠需给药30天，猴需给药90天；镇静催眠药在小、大鼠需给药6090天，猴需给药180天。每天上下午各一次 身体依赖性试验-自然戒断

47、试验 观察指标：镇痛药在停药前24h及停药后48h内每隔4h观察记录外观体征和行为活动、植物神经系统机能变化，并称重。镇静催眠药在停药前一天及停药后的1至2周内每天观察动物的外观体征和行为活动及自发惊厥发生率 外观体征和行为活动包括：应激性、神情过敏(猴)、饮食、睡眠、自发运动活动、攻击性、警觉程度、神经反射、竖尾、震颤、惊厥、呼吸、体温、体重 植物神经系统机能变化：腹泻、流涎、流泪、恶心、呕吐、瞳孔大小身体依赖性试验-自然戒断试验 资料记录及整理：动物应写明种属、性别、生产合格证号、记录体重、实验室温度及湿度 受试物应写明生产批号、配制方法 戒断症状用记分法统计，对检测指标和体重、惊厥发生率

48、等应设计合理的图表显示。实验结果进行统计处理身体依赖性试验-替代试验 给予动物代表药(如吗啡、巴比妥或苯巴比妥)产生身体依赖性后，停止给药，替之以受试药，观察记录动物是否发生戒断症状及发作程度 动物：参照“自然戒断试验”剂量：参照“自然戒断试验”给药途径：腹腔注射、灌胃或“药掺食”(drug admixed food,DAF)法给予代表药使产生身体依赖性，然后停止给代表药，以同样给药方式给予不同剂量的受试药,观察及记录替代期间动物的戒断行为和体重变化身体依赖性试验-替代试验 镇痛药的观察期为停止吗啡前24h和停药后48h内，每4h观察一次；镇静催眠药的观察为停止代表药前一天和停药后的12周内，

49、每天观察一次 采用12种给药途径，必须有一种与临床用药途径相同 观察指标：参照“自然戒断试验”资料记录与整理：参照“自然戒断试验”身体依赖性试验-诱导试验 应用各种诱发惊厥的方法如听源性发作和戊四唑惊厥，对镇静催眠药产生身体依赖性的动物，在断药期间阈下刺激强度就可出现反跳性兴奋，诱发惊厥 动物：大、小鼠。应预先挑选对各种阈下刺激无惊厥反应鼠 剂量：参照“自然戒断试验”，阳性代表药为苯巴比妥或巴比妥身体依赖性试验-诱导试验 给药途径：二种，有一种同临床途径 给药期限：30天，每天二次，上、下午各一次 观察指标：听源性发作实验在停药后的一周内每天记录发作率和体重；戊四唑实验在停药24h后记录一次发

50、作率和体重 资料记录及整理：参照“自然戒断试验”精神依赖性试验 采用”自身给药“测定iv药物对动物的强化效应 动物：200250g的健康大鼠，各半 剂量：12个剂量组，加上一个阳性药对照组(阿片类-盐酸吗啡，镇静催眠-苯巴比妥钠或戊巴比妥钠)，每组10只动物。方法：戊巴比妥钠麻醉下行颈外静脉插管术，将插管一端固定于血管内，另一端与恒速泵及药液输入系统相连。术后第二天开始对大鼠进行自身给药训练，直至动物建立自身给药(踏板)行为精神依赖性试验 观察指标：包括形成自身给药行为的潜伏期、每个实验期内大鼠的自身给药次数、行为变化、自身给药行为随药物浓度变动的变化程度、消退反应、与其它药物的相互替代等 资