临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用临检培训班课件.ppt

1、基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用刘敬忠刘敬忠 首都医科大学附属北京朝阳医院首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所北京朝阳医院法医物证司法鉴定所中心法则中心法则 复复 转录转录 翻译翻译 DNA RNA DNA RNA 蛋白质蛋白质 蛋白蛋白 制制 反转录反转录 糖蛋白糖蛋白 脂蛋白脂蛋白 酶类酶类 激素激素 细胞因子细胞因子 基因重组技术基因重组技术 基因探针技术基因探针技术 基因重组药物基因重组药物 基因诊断基因诊断 基因治疗基因治疗 PKUPKU 尿毒症（口服尿毒症（口服artificial cells)artificial

2、cells)基因诊断基因诊断 运用基因探针，运用基因探针，PCRPCR技术等探测特定靶基技术等探测特定靶基因的存在与否，或是否有基因突变等缺陷，从因的存在与否，或是否有基因突变等缺陷，从而对疾病或病原体感染作出诊断叫基因诊断。而对疾病或病原体感染作出诊断叫基因诊断。基因型基因型 表表 型型 基基 临临 血血 生生 细细 影影 病病 因因 床床 清清 化化 菌菌 像像 理理 诊诊 学学 学学 学学 学学 学学 断断 诊诊 诊诊 诊诊 诊诊 诊诊 诊诊 断断 断断 断断 断断 断断 断断基因诊断的特点基因诊断的特点灵敏度高（早期）灵敏度高（早期）特异性强特异性强操作简便操作简便取材大多不受组织器官

3、限制取材大多不受组织器官限制可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断检测细菌内病毒等微生物时不需培养检测细菌内病毒等微生物时不需培养聚合酶链反应聚合酶链反应Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction（PCRPCR）Kary B.Mullis1984 年问世年问世,成为分子生物学和生命科学成为分子生物学和生命科学发展史上的里程碑发展史上的里程碑1993 荣获诺贝尔奖荣获诺贝尔奖 Mendocin 128号公路附近一棵七叶树下的号公路附近一棵七叶树下的突发奇想突发奇想专利官司之战专利官司之战:DuPont 与

4、与Cetus对薄公堂对薄公堂 PCR PCR 原理示意图原理示意图PCRPCR技术的应用技术的应用一、在分子生物学研究中的应用一、在分子生物学研究中的应用二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断：二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断：血友病、血友病、地中海贫血、地中海贫血、DMD、PKU等等等等三、细菌、支原体、衣原体、立克次体等三、细菌、支原体、衣原体、立克次体等四、病毒四、病毒五、白血病、肿瘤五、白血病、肿瘤六、骨髓移植、器官移植供体配型选择六、骨髓移植、器官移植供体配型选择七、法医学七、法医学八、动植物学八、动植物学九、古人类学、古生物学九、古人类学、古生物学 PCR原理示意图原理示意图热变性：

5、从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞热变性：从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的提取的DNA约约1ug，在含有适当缓冲液、引物、，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及及dTTP）等）等的反应混合物中，在的反应混合物中，在94下热变性下热变性4分钟，使之分钟，使之解为单链。解为单链。退火：然后置反应混合物于退火：然后置反应混合物于55，使引物与，使引物与解为单链的解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之上互补序列杂交在一起，称之为退火。并迅速加入为退火。并迅速加入2单位耐热的单位耐热的Taq DNA聚聚合酶，混匀、离心合酶，混匀、离心10秒钟。为防止在整个秒钟。为防止在

6、整个PCR过程中，水份的蒸发影响过程中，水份的蒸发影响PCR效果，通常加入效果，通常加入35ul石蜡油封盖液面。石蜡油封盖液面。引物延伸：置上述反应混合物于引物延伸：置上述反应混合物于70水浴中水浴中1-2分钟，在分钟，在DNA聚合酶催化作用下，以聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的为原料（底物），从引物的3端端A开始开始,沿着沿着53的方向，合成每条模板的互补链，此的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。结果，称引物延伸。结果，DNA拷贝数增加了一倍。拷贝数增加了一倍。接着，将上述热变性接着，将上述热变性退火退火引物延伸（称为一引物延伸（称为一个循环）反复进行个循环）反

7、复进行30-35次。只是热变性的时间缩次。只是热变性的时间缩短为短为1分钟左右。每经过一个循环，分钟左右。每经过一个循环，DNA拷贝数便拷贝数便增加一倍（增加一倍（2）。因此，如进行）。因此，如进行n次循环，则拷贝次循环，则拷贝数将增加数将增加2n倍！进行倍！进行25个循环，则拷贝数将增加个循环，则拷贝数将增加225倍，即上百万倍。在琼脂糖凝胶电泳上可看到倍，即上百万倍。在琼脂糖凝胶电泳上可看到特异性长度的扩增带。可见特异性长度的扩增带。可见PCR之所以高速扩增的之所以高速扩增的关键是因为每次新合成的关键是因为每次新合成的DNA链在后来的循环中都链在后来的循环中都可以作模板，犹如滚雪球，数量迅

8、速增加。可以作模板，犹如滚雪球，数量迅速增加。如果引物如果引物5端有几个与模板端有几个与模板DNA不配对的碱不配对的碱基，仍可能与模板基，仍可能与模板DNA退火、延伸，对退火、延伸，对PCR效效果影响不大。这一特点，可使果影响不大。这一特点，可使PCR产物两端带上产物两端带上限制酶的限制酶的Linker，或造成，或造成DNA顺序的缺失、插顺序的缺失、插入、碱基替代等。大大增大了入、碱基替代等。大大增大了PCR技术的应用范技术的应用范围。围。影响影响PCR效果的重要因素及注意事项：效果的重要因素及注意事项：PCR技术的原理似乎非常简单明了，技术的原理似乎非常简单明了，PCR反应反应的操作也并不复

9、杂；但要取得好的结果和良好的的操作也并不复杂；但要取得好的结果和良好的可重复性并非易事。必须彻底弄通其分子生物学可重复性并非易事。必须彻底弄通其分子生物学的奥妙之处，并把握其各种影响因素，规范操作。的奥妙之处，并把握其各种影响因素，规范操作。以下列出影响以下列出影响PCR扩增效果的主要因素扩增效果的主要因素 引物设计一定要科学合理，序列的特异性要高。引物设计一定要科学合理，序列的特异性要高。长度一般在长度一般在18-25个碱基，个碱基，Tm值可按公式值可按公式（G+C总数总数x4）+（A+T总数总数x2）（）（）估）估算。算。尽可能避开尽可能避开4个以上个以上G或或C等相同碱基串联重复。等相同

10、碱基串联重复。尽可能避免引物内部形成发夹结构或引物之间尽可能避免引物内部形成发夹结构或引物之间形成二聚体（形成二聚体（Dimer）的可能性。）的可能性。G、C与与A、T的比例尽可能的比例尽可能1:1左右。左右。同一反应管中的引物（甚至同一个同一反应管中的引物（甚至同一个Lab的所有的所有引物）引物）Tm值设计的相同。值设计的相同。引物在反应体系中的浓度要经过优化。双重引物在反应体系中的浓度要经过优化。双重PCR及多重及多重PCR对各引物浓度间的比例要求更对各引物浓度间的比例要求更严。严。基因组基因组DNA制备液纯度要好。其用量也并非制备液纯度要好。其用量也并非越多越好。越多越好。各种试剂小量分

11、装保存，避免多次冻融。各种试剂小量分装保存，避免多次冻融。dNTP浓度要优化。浓度要优化。退火温度参考退火温度参考Tm值进行优化。其对值进行优化。其对PCR的的成败，非特异产物的出现与否关系最大。成败，非特异产物的出现与否关系最大。Taq DNA聚合酶的厂牌、批号和用量均要聚合酶的厂牌、批号和用量均要合适。合适。对扩增难度较大的对扩增难度较大的PCR，Mg2+浓度要适当浓度要适当增加。增加。操作者的手法也有影响，要在实践中总结提操作者的手法也有影响，要在实践中总结提高技术。高技术。荧光定量PCR行HLA-DrB1位点分型法的建立及与血清学方法的比较HLA分型技术分型技术HLA（人类白细胞抗原）

12、（人类白细胞抗原）MHC区基因（主要组织相容性复合物基因区）区基因（主要组织相容性复合物基因区）高度多态性的基因区高度多态性的基因区HLA分型技术分型技术一、淋巴细胞微量细胞毒试验一、淋巴细胞微量细胞毒试验 1964年，年，Paul Terasaki,LA,USA二、二、DNA分型法分型法 优点：优点：1.血样不要求新鲜血样不要求新鲜;2.白血病患者白血病患者WBC表面抗原被破坏表面抗原被破坏,只只 能用能用DNA分型法分型法;3.结果更准确可靠结果更准确可靠HLA分型技术分型技术vDNA-RPLP,1982vPCR/SSOvPCR/反向斑点杂交反向斑点杂交vPCR/SSCPvPCR/SSPv

13、PCR/SBTvR-Q-PCR/SSPvPCR/dHPLC等等 在序列特异性引物聚合酶链反应（在序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSPPCR-SSP）技术基础上，将）技术基础上，将荧光定量荧光定量PCRPCR（FQ-PCRFQ-PCR）技术与）技术与SSPSSP结合起来，建立了自动化程度更高结合起来，建立了自动化程度更高的荧光定量的荧光定量PCR-HLAPCR-HLA分型技术，完成了分型技术，完成了4646例尸肾供受者的例尸肾供受者的HLA-DBR1HLA-DBR1分分型。型。FQ-PCRFQ-PCR不需走电泳，减少了污染的机会，提高了自动化程度。不需走电泳，减少了污染的机会，提高了自动化

14、程度。同时又开展了以同时又开展了以DNADNA测序为基础的测序为基础的HLAHLA分型（分型（SBTSBT）技术。）技术。三、主要方法：三、主要方法：1 1、HLAHLA血清学分型。血清学分型。2 2、常规、常规PCR-SSPPCR-SSP反应。反应。3 3、SBTSBT分型法：分型法：(1)PCR(1)PCR扩增扩增DRB1DRB1片段。片段。(2)(2)用用ABI-373ABI-373型自动测序仪测序。型自动测序仪测序。(3)(3)测序数据分析及分型。测序数据分析及分型。结果和讨论结果和讨论一、进行一、进行PCR-SSPPCR-SSP法法HLA-DRB1HLA-DRB1位点分型：位点分型：

15、4、荧光定量PCR技术原理：图3、荧光定量PCR中反应前的模板浓度与Ct值成反比v图图4 4、15 R-II15 R-II号样本荧光定量分型结果号样本荧光定量分型结果v图图5 5、SSPSSP分型结果与上述一致分型结果与上述一致FQ-PCRFQ-PCR分型的优点：分型的优点：(1)(1)荧光定量分型法省去了电泳分析、荧光定量分型法省去了电泳分析、UVPUVP成像成像的操作，简化步骤，提高自动化程度，减少了的操作，简化步骤，提高自动化程度，减少了工作量。工作量。(2)(2)判读结果与扩增由仪器同时完成，节省了判读结果与扩增由仪器同时完成，节省了PCRPCR后处理的时间，结果更客观。后处理的时间，

16、结果更客观。(3)(3)将引物的特异性和探针的特异性结合，提高将引物的特异性和探针的特异性结合，提高了准确性。了准确性。(4)(4)只需在反应前打开离心管一次，即可只需在反应前打开离心管一次，即可完成所有的操作，减少了污染的机会，完成所有的操作，减少了污染的机会，进一步提高了特异性和灵敏性。进一步提高了特异性和灵敏性。(5)(5)本本FQ-PCR HLA DRB1FQ-PCR HLA DRB1配型较常规配型较常规FQ-FQ-PCRPCR减少了合成的荧光探针数量。减少了合成的荧光探针数量。(6)(6)可得出起始模板拷贝数定量结果。可得出起始模板拷贝数定量结果。基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用

17、基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用特点：特点：PCR技术一问世，首先就应用于技术一问世，首先就应用于珠蛋白生成障碍珠蛋白生成障碍性贫血等遗传病的基因诊断。性贫血等遗传病的基因诊断。不但要查特定基因是否存在，而且要查出相应功能不但要查特定基因是否存在，而且要查出相应功能基因的缺陷：突变？缺失？插入？倒位？等等。基因的缺陷：突变？缺失？插入？倒位？等等。采用的技术更复杂、多样，与检测病毒、细菌的要采用的技术更复杂、多样，与检测病毒、细菌的要求不完全相同。求不完全相同。实验室的验收。实验室的验收。基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用技术：技术：PCR/凝胶电泳凝

18、胶电泳 PCR/RFLP PCR/SSCP PCR/ASO(Allile-specific oligoprobe)PCR/sequencing ASA(Allile-specific Amplification)m-PCR(multiplex PCR)F-Q-PCR(Real-Time PCR)血友病甲基因诊断刘敬忠，梁燕，王立荣，肖白，刘敬忠，梁燕，王立荣，肖白，朱章菱，周艳，刘亮，张晶朱章菱，周艳，刘亮，张晶 首都医科大学附属北京朝阳医院首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所北京朝阳医院法医物证司法鉴定所甲型血友病甲型血友病因子基

19、因倒位的研究及检测新技术：因子基因倒位的研究及检测新技术：血友病甲（血友病甲（HA）是常见的）是常见的X-连锁遗传性出血性疾病，是连锁遗传性出血性疾病，是由于凝血因子由于凝血因子（F）基因缺陷所致。约半数重型）基因缺陷所致。约半数重型HA的患的患者，是由于者，是由于F基因第基因第22内含子（内含子（IVS22）发生基因倒位所致。）发生基因倒位所致。迄今，国际上检测这种基因倒位都是用迄今，国际上检测这种基因倒位都是用Southern印迹杂交技印迹杂交技术。虽然这种技术能够准确的查出这种基因倒位，但操作步术。虽然这种技术能够准确的查出这种基因倒位，但操作步骤多，流程长，出结果慢，难度大，需要骤多，

20、流程长，出结果慢，难度大，需要DNA样品量大以及样品量大以及操作放射性同位素标记的探针等。我们从操作放射性同位素标记的探针等。我们从1996年开始在国际年开始在国际上率先研究利用长距离上率先研究利用长距离DNA扩增技术（扩增技术（LD-PCR），替代），替代Southern杂交进行杂交进行F基因倒位的诊断。经过近二年的努力基因倒位的诊断。经过近二年的努力终获成功，并进行了推广应用。主要完成了以下几方面工作终获成功，并进行了推广应用。主要完成了以下几方面工作：自行设计合成了长距离自行设计合成了长距离PCR的四个引物的四个引物P、Q、A、B。预。预期扩增产物长度期扩增产物长度P/Q为为12Kb，A

21、/B为为10Kb，P/B及及A/Q为为11Kb。四引物及三引物四引物及三引物LD-PCR体系的比较体系的比较 系统优化了引物浓度，酶用量，系统优化了引物浓度，酶用量，deaza-dGTP的比例，的比例，DMSO浓度，基因组浓度，基因组DNA的质量和用量，退火及延伸温度、的质量和用量，退火及延伸温度、时间，低浓度琼脂糖凝胶电泳条件及操作方法等。使时间，低浓度琼脂糖凝胶电泳条件及操作方法等。使10-12Kb DNA扩增及检测倒位终获成功。这充分体现了该成果扩增及检测倒位终获成功。这充分体现了该成果的科学性和先进性的科学性和先进性不同量模板不同量模板DNADNA对对LD-PCR LD-PCR 的影响

22、的影响1-51-5号的号的DNADNA量分别为量分别为0.250.25，0.50.5，0.750.75，1.01.0，1.25g1.25g不同量不同量deaza-dNTPdeaza-dNTP对对LD-PCRLD-PCR的影响的影响1-51-5号号dNTPdNTP浓度分别为浓度分别为200200，300300，400400，500500，600M600M 53份重型份重型HA患者及家系成员患者及家系成员DNA标本，分别用经典标本，分别用经典的的Southern印迹杂交和本印迹杂交和本LD-PCR技术在双盲条件下进行技术在双盲条件下进行F基因倒位检测。两者得出的诊断结论完全一致。表明基因倒位检测。

23、两者得出的诊断结论完全一致。表明用用LD-PCR技术诊断该基因倒位，检出携带者的特异性和技术诊断该基因倒位，检出携带者的特异性和灵敏度均达到百分之百。而且具有操作步骤较简便，需灵敏度均达到百分之百。而且具有操作步骤较简便，需DNA量少，出结果快，不需操作放射性同位素标记探针，量少，出结果快，不需操作放射性同位素标记探针，在无法取得先症者患儿血样的情况下，也可直接查携带者在无法取得先症者患儿血样的情况下，也可直接查携带者是否携带倒位基因，如果是可直接做产前诊断等优点。是否携带倒位基因，如果是可直接做产前诊断等优点。双盲实验（双盲实验（5353份份DNADNA）结果证明：）结果证明：LD-PCRL

24、D-PCR可可独立用于重型独立用于重型HAHA基因倒位的检测基因倒位的检测编 号带 型LD-PCR诊断结果3,4,5,9,10,14,16,17,25,27,28,30,32,36,37,39,42,44,49,51,53,55,5711Kb倒位者2,6,8,11,12,15,20,23,24,26,29,31,33,35,38,40,41,43,45,46,47,48,50,52,56,59,6012Kb野生型1,54,5812Kb11Kb携带者应用实验成功的应用实验成功的LD-PCR技术，对来自北京、天津、江苏、技术，对来自北京、天津、江苏、湖北、广西、四川、山东、福建等省市的湖北、广西、

25、四川、山东、福建等省市的108 个重型个重型HA患患者及数目不等的家系成员进行了检测，共查出者及数目不等的家系成员进行了检测，共查出F基因倒基因倒位位47例，占例，占44%，与国际上用，与国际上用Southern杂交技术查出的基杂交技术查出的基因倒位引起的因倒位引起的HA约占重型约占重型HA的的40-50%一致。另外，检出一致。另外，检出30余位倒位基因携带者，为将来开展产前基因诊断，杜绝余位倒位基因携带者，为将来开展产前基因诊断，杜绝新的新的HA患儿出生打下了基础，对优生、提高人口素质有患儿出生打下了基础，对优生、提高人口素质有重要意义。重要意义。14个个DNA标本标本LD-PCR电泳结果电

26、泳结果M：DNA/Hind酶解产物，三条带分别为酶解产物，三条带分别为23.1kb，9.4kb，6.6kb美国美国Steve.S.Sommer去年与我们同期发表了一篇类似技术去年与我们同期发表了一篇类似技术方法的摘要文章。但我们较他们有两个显著不同特点：一方法的摘要文章。但我们较他们有两个显著不同特点：一是我们强调了运用是我们强调了运用P、Q和和B这三个引物就完全可以满足诊这三个引物就完全可以满足诊断的需要，省去一个引物断的需要，省去一个引物A，减少一条，减少一条10Kb扩增带。这条扩增带。这条10Kb带是多余的，且使带是多余的，且使11Kb及及12Kb带出现的难度增大。带出现的难度增大。二是

27、我们研究成功方法后，立即迅速应用于患者及其家系二是我们研究成功方法后，立即迅速应用于患者及其家系的诊断和携带者检出，现已达一百余家系，产生了很大社的诊断和携带者检出，现已达一百余家系，产生了很大社会效益和一定的经济效益，并开始向兄弟单位推广应用。会效益和一定的经济效益，并开始向兄弟单位推广应用。HA8家系家系 PCR/Bcl酶解分析结果酶解分析结果M:pBR322/Msp；0:-2（酶解前）扩增带长（酶解前）扩增带长374bp，图中，图中211bp和和163bp为酶解后产物为酶解后产物 M 3 1 2 1 2 0 HA15家系家系 St14位点位点VNTR多态基因连锁分析结果多态基因连锁分析结

28、果M:X174/Hae M 12321 M 12321HA18家系内含子家系内含子13（A）和内含子）和内含子22（B）可变串联重复数目多态性分）可变串联重复数目多态性分析结果析结果A为内含子为内含子13中（中（CA）重复分型结果：）重复分型结果：-1为为21/-，-2为为21/20，-2为为22/20，-1为为21/-，-1为为21/21，她是携带者；，她是携带者；B为内含子为内含子22中（中（GT）（AG）重复分型结果：）重复分型结果：-1为为26/-，-2为为26/26，-2为为27/26，-1为为26/25，-1为为25/-1 2 2 1 1 1 2 2 1 1血友病乙的基因诊断，携带

29、者检出和产前诊断刘敬忠刘敬忠 首都医科大学附属北京朝阳医院首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所北京朝阳医院法医物证司法鉴定所血友病乙的基因诊断，携带者检出和产血友病乙的基因诊断，携带者检出和产前诊断前诊断缺失型-地中海贫血基因诊断技术的改进刘敬忠，周桔，王立荣，周艳刘敬忠，周桔，王立荣，周艳 首都医科大学附属北京朝阳医院首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所北京朝阳医院法医物证司法鉴定所临床诊断临床诊断Barts（-/-/-）v基因型基因型v临床分型临床分型静止型静止型（-

30、/）-SEA-3.7-4.2标准型标准型（-/-/）HbH病病（-/-/-）问题：问题：PCR技术可重复性差技术可重复性差,难度大，难度大，结果判断复杂，结果判断复杂，引物设计有待改进引物设计有待改进 措施：措施：1、重新设计引物、重新设计引物 2、改进和优化、改进和优化PCR反应体系反应体系 酶、酶、deaza-dGTP、DMSO、退火温度、退火温度、gradient gel等等 A B C A B C GE S1 S2 S3 M1 1 2 3 4 5 6 M2 7 8 9 M2 10 11 12 M31.2%/2.0%浓度梯度琼脂糖凝胶浓度梯度琼脂糖凝胶1，4，正常（，正常（/）；）；2，

31、5，-3.7/；3，6，-3.7/-SEA；7，/；8，-4.2/；9，12，-4.2/-SEA；10，/；11，-SEA/-SEA；12，9，-4.2/-SEA1.58Kb287 bp173 bp1.9 Kb1.7 Kb根据本试剂盒三个根据本试剂盒三个PCR反应产物的电泳图谱作反应产物的电泳图谱作出基因诊断出基因诊断 引物 扩增带基因型 S1 /S2 /S3G /E A /B /C/287 bp 1.9 Kb/-287 bp 1.7 Kb,1.9 Kb/-287 bp1.58 Kb 1.9 Kb/-287 bp，173 bp 1.9 Kb-/-287 bp 1.7 kb-/-287 bp1.

32、58 Kb 1.7 Kb-/-287 bp1.58 Kb-/-287 bp，173 bp 1.7 Kb-/-287 bp，173 bp1.58 Kb-/-173 bp 引物 扩增带基因型 S1 /S2 /S3G /E A /B /C/287 bp 1.9 Kb/-287 bp 1.7 Kb,1.9 Kb/-287 bp1.58 Kb 1.9 Kb/-287 bp，173 bp 1.9 Kb-/-287 bp 1.7 kb-/-287 bp1.58 Kb 1.7 Kb-/-287 bp1.58 Kb-/-287 bp，173 bp 1.7 Kb-/-287 bp，173 bp1.58 Kb-/-

33、173 bp单管四重单管四重PCR试剂盒检测试剂盒检测-珠蛋白的基因珠蛋白的基因三种缺失类型及引物设计示意图三种缺失类型及引物设计示意图 10种种DNA的四重的四重PCR图谱图谱M N -3.7/aa -4.2/aa -3.7/-3.7 -4.2/-4.2-3.7/-4.2-/-3.7/-4.2/-aa/-all M运运用用单单管管四四重重PCR检检测测导导致致-地地中中海海贫贫血血的的-珠珠蛋蛋白白基基因因3种种缺缺失失-3.7(-3.7),右缺；-4.2(-4.2),左缺;-(-SEA),东南亚缺失;M:DNA/EcoR I+HindKb1.91.61.50.825个海南黎族人个海南黎族人

34、DNA的扩增图谱的扩增图谱 20个广西、广东个广西、广东-地贫地贫68标本的多重标本的多重PCR扩增图扩增图根据图谱作出诊断根据图谱作出诊断 扩增带电扩增带电电泳图电泳图 及诊断及诊断序号序号 0.8Kb 1.6Kb1.9Kb1.5Kb诊诊 断断1-+-正常正常(/);但不排除但不排除/T的可能性的可能性2-+-3.7携带者携带者(-3.7/)3-+-4.2携带者携带者(-4.2/)4-+-3.7纯合子纯合子(-3.7/-3.7)5-+-4.2纯合子纯合子(-4.2/-4.2)6-+-+-3.7/-4.2双重杂合子双重杂合子 7+-SEA/-SEA巴氏水肿胎儿巴氏水肿胎儿 8+-SEA/-3.

35、7(缺失型缺失型HbH病病)9+-+-SEA/-4.2(缺失型缺失型HbH病病)10+-+-SEA/（-SEA携带者）携带者）-SEA/T(非缺失型非缺失型HbH病病)11-PCR失败失败,查找原因查找原因,重复作重复作 DNA的提取方法：的提取方法：盐析法盐析法 酚酚-氯仿抽提法氯仿抽提法 Chelex快速法快速法0.8kb质粒灵敏度检测0.8kb稳定性结果稳定性结果:1#-a 3.7/-2#-a 4.2/-3#aa/-4#-a 3.7/-a 4.2 5#aa/-0小时 48小时 72小时 96小时31例阳性标本 29例阳性标本 60例阴性标本B7 B12，E8B11B7,B11,B12:-

36、a 3.7/-1#1.0ul 2#2.0ul 3#3.0ul4 例例 可可 疑疑 标标 本本 的的 鉴鉴 定定206bp替代替代109bp 10-8=33拷贝拷贝 灵敏度206bp标准曲标准曲线线灵敏度灵敏度436bp试剂盒检测结果试剂盒检测结果0.2ug 0.1ug 0.05ug 0.02ug 0.01ug 平行性0小时 48小时 72小时 96小时436bp稳定性结果 1#-a 3.7/-2#-a 4.2/-3#-a 3.7/-a 4.2 4#-a 4.2/-a 4.2 5#-/-60例阳性标本及4例阴性标本1.5kb试剂盒引物优试剂盒引物优化化1#G/E+2 2#G+2/4.2R 3#G

37、/4.2R 4#G+2/E+2SYBR-PCR/D.C.SYBR-PCR/D.C.技术的优点技术的优点:RealTime-PCR的优点的优点.不需探针不需探针易优化易优化 等等后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考，实际情况实际分析主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求The user can demonstrate on a projector or computer,o

38、r print the presentation and make it into a film to be used in a wider field后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考，实际情况实际分析主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field