鼻息肉上皮细胞原代培养体系的建立以及TGF治疗意义的研究课件.ppt

1、主要介绍主要介绍 INSERM U492 的研究课题的研究课题 法国法国INSERM U 492实验室进行气实验室进行气-液界面液界面培养鼻息肉培养鼻息肉(nasal polyps,NP)上皮细胞多年，上皮细胞多年，已积累相当经验，对呼吸道粘膜上皮细胞培养的已积累相当经验，对呼吸道粘膜上皮细胞培养的技术已经比较成熟。技术已经比较成熟。这里介绍一种呼吸上皮细胞原代培养技术并这里介绍一种呼吸上皮细胞原代培养技术并建立损伤和修复模型的方法，为今后鼻息肉上皮建立损伤和修复模型的方法，为今后鼻息肉上皮细胞的研究以及鼻息肉产生和复发机制研究提供细胞的研究以及鼻息肉产生和复发机制研究提供一个途径。一个途径。

2、材料和方法 标本来源于法国标本来源于法国IntercommunalIntercommunal 医院耳鼻医院耳鼻咽喉咽喉-头颈外科行鼻内镜下鼻息肉摘除手头颈外科行鼻内镜下鼻息肉摘除手术时切除的鼻息肉组织术时切除的鼻息肉组织 共共2222例。患者年龄例。患者年龄27-6127-61岁，平均年龄岁，平均年龄4040岁，男性岁，男性1717例，女性例，女性5 5例例 标本处理：用标本处理：用PBS加加DTT的冲洗液冲洗标的冲洗液冲洗标本，基本将红细胞冲洗干净后，只留下了本，基本将红细胞冲洗干净后，只留下了息肉组织，将标本组织放入配制好的蛋白息肉组织，将标本组织放入配制好的蛋白酶消化液酶消化液4冰箱静置

3、过夜。冰箱静置过夜。基本步骤：1.DISSOCIATION 2.ENSEMENCEMENT 3.CULTURE 5%FCS（Fetal calf serum）45ml用力摇动，充分使细胞用力摇动，充分使细胞分离，用小网过滤至烧杯。将滤液倒入试管离心分离，用小网过滤至烧杯。将滤液倒入试管离心7分钟，分钟，1500转转/分钟。弃上清液，加蛋白酶消化液（分钟。弃上清液，加蛋白酶消化液（trypsine）,用吸管搅动吹打，离心用吸管搅动吹打，离心7分钟。弃上清液，再加分钟。弃上清液，再加15mlFCS，混匀后开始细胞计数，根据细胞数用混匀后开始细胞计数，根据细胞数用FCS配制成每毫升配制成每毫升10,

4、000,000个细胞的混悬液。选个细胞的混悬液。选12孔培养板，每孔加孔培养板，每孔加1ml细胞悬液，置细胞悬液，置37CO2孵箱过夜，让细胞在滤膜底部沉孵箱过夜，让细胞在滤膜底部沉淀贴壁。每个标本至少可制成淀贴壁。每个标本至少可制成48孔的培养细胞。次日取孔的培养细胞。次日取出培养板，小心吸去滤膜上的上清液。加出培养板，小心吸去滤膜上的上清液。加371mlPBS冲冲吸滤膜三到五次，吸去上清液，镜下观察上皮细胞在滤吸滤膜三到五次，吸去上清液，镜下观察上皮细胞在滤膜贴壁良好后，放入膜贴壁良好后，放入37CO2孵箱培养，每天更换培养孵箱培养，每天更换培养液。液。损伤和修复模型的建立损伤和修复模型的

5、建立：1 设立模型组和培养组，每组设立模型组和培养组，每组11例标本，每例标例标本，每例标本不少于本不少于12孔。孔。2 模型组于第模型组于第5天，用吸管尖部于培养盘中间纵天，用吸管尖部于培养盘中间纵形快速均匀压划，造成细胞损伤。形快速均匀压划，造成细胞损伤。3 两组培养过程相同。两组培养过程相同。结结 果果 分别于第分别于第5天天(d5)、第、第8天天(d8)、第、第14天天(d14)时对培养组和模型组同时观察细胞生时对培养组和模型组同时观察细胞生长情况并进行比较。结果表明：显微镜下，模长情况并进行比较。结果表明：显微镜下，模型组细胞在损伤后型组细胞在损伤后3天已出现良好的愈合性生天已出现良

6、好的愈合性生长。但与正常生长上皮细胞有所不同。与周边长。但与正常生长上皮细胞有所不同。与周边细胞界限清楚且纤毛细胞略少。细胞界限清楚且纤毛细胞略少。培养组（均值）培养组（均值）模型组（均值）模型组（均值）R ddp R ddpD5 72823 40.46.7 74924 38.57.2D8 88326 49.97.5 87125 46.57.8D14 97829 37.97.9 96121 36.98.1 结结 论论 取材取材NP上皮细胞进行上皮细胞进行ALI培养呼吸培养呼吸上皮细胞是一种最为实用和无损伤正常上皮细胞是一种最为实用和无损伤正常粘膜的方法。粘膜的方法。NP上皮细胞损伤和修复模型的建立，上皮细胞损伤和修复模型的建立，方法简单，损伤后方法简单，损伤后3天损伤细胞基本修复，天损伤细胞基本修复，但镜下观察仍能看到上皮细胞的愈合痕但镜下观察仍能看到上皮细胞的愈合痕迹。这就提供了对上皮细胞损伤和修复迹。这就提供了对上皮细胞损伤和修复过程研究的一个途径。过程研究的一个途径。NP上皮细胞原代培养以及损伤和修复模上皮细胞原代培养以及损伤和修复模型的建立后，是进一步深入研究呼吸上皮的一型的建立后，是进一步深入研究呼吸上皮的一种较好的方法。值得应用。种较好的方法。值得应用。