目的基因的克隆与基因文库的构建精美生物医学讲课课件.pptx

1、请你找找看请你找找看n什么是基因文库，由哪两部分组成呢？n构建基因文库由什么用呢？n构建一个基因文库都有哪些基本步骤，请概括！一基因文库概述 1、概念基因文库(library)：一套包含某生物体 所有基因的DNA序列。这些序列分别与适当的载体结合在一起。2、基本组成、基本组成包括：基因组文库、包括：基因组文库、cDNA文库文库cDNA：由：由mRNA逆转录的逆转录的DNA，因此，因此不不 含含非转录的基因组序列。非转录的基因组序列。单链单链cDNA可由可由DNA聚合酶转变成双链，应用于聚合酶转变成双链，应用于基因工程。基因工程。出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的

2、l-DNA或考斯质粒；cDNA文库（cDNA library）限制性内切酶部分酶切两种方法。a、DNA变性（90-96）：双链DNA模板用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？cDNA：由mRNA逆转录的DNA，因此不连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级在热作用下，_断裂，形成_转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库重组克隆能稳定保存、扩增、筛选克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆

3、排序工作量较大，需要了解目的基因的背景知识基因组文库基因组文库 Genomic DNA libraryGenomic DNA library使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组的基因组DNADNA切割成许多片段切割成许多片段将所有片段连接到载体上，构成一个重组将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNADNA群体群体这个群体包含这个群体包含全基因组全基因组的遗传信息的遗传信息cDNA文库（cDNA library）以以mRNAmRNA为模板，经反转录酶合成互补为模板，经反转录酶合成互补 DNA(complementary DNA DNA(compl

4、ementary DNA，cDNA)cDNA)将双链将双链cDNAcDNA与适当载体连接与适当载体连接 转化到宿主细胞内进行扩增，建成转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNAcDNA文库文库 基因组文库与基因组文库与 cDNA cDNA文库的比较：文库的比较：基因组文库包含基因组的所有基因 cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列 分离特定基因，cDNA库比较方便 研究调控序列，必须用到基因组文库3、构建目的创建基因文库的创建基因文库的目的目的：从特定的材料中分离目：从特定的材料中分离目 的的DNADNA片段或基因。片段或基因。把所有的基因集中在一个库中，采用一定的

5、方把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。法在库中筛选目的基因。同时也便于基因的长期保存。同时也便于基因的长期保存。提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）片段）mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物该生物cDNA文库文库5、基因文库的质量标准 尽可能高的完备性重组克隆的总数

6、不宜过大 以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选二、二、目的基因的克隆用限制酶切断成许用限制酶切断成许多片段多片段1 1、直接分离法、直接分离法“鸟枪法鸟枪法”鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构2 2、人工合成基因法：、人工合成基因法：1 1）逆转录法：）逆转录法：mRNAmRNA双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因)逆转录酶逆转录酶单链单链DNAD

7、NA合成合成2 2）直接合成法：）直接合成法：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因（双链）目的基因（双链）化学合成化学合成DNA合成仪合成仪推推测测推推测测合合成成4 4、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段5 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC CC C5 5/3 3/引物引物G GG G1.目的基因受热变

8、性，解旋；目的基因受热变性，解旋；2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.合成链在合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。5 5/3 3/A AG G引物引物(2)(2)利用利用扩增扩增原理：原理：_DNADNA复制复制条件：条件：_、_、_ _、_(_(做启动子做启动子)。已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶、解旋酶聚合酶、解旋酶方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）指数指数2 2n n结果：结果：使目的基因的片段在使目的基因的片段在短时间内成百万倍

9、地扩增短时间内成百万倍地扩增过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性25-6525-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链从基因库中筛选特定的克隆（2）cDNA文库的构建m

10、RNA反转录形成反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物；重组克隆能稳定保存、扩增、筛选的DNA片段或基因。当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。这个群体包含全基因组的遗传信息基因组文库与 cDNA文库的比较：重组克隆能稳定保存、扩增、筛选由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒克隆片段易于从载体分子上完整卸下限制性内切酶部分酶切两种方法。二、筛选：从基因文库中筛选目的基因找出含有目的基因的细胞基因组文库 Genomic DNA library三、基因文库的构建（一）切割：基因

11、组DNA的分解 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！载体和受体的选择n出于压缩重组克隆的数量，用于出于压缩重组克隆的数量，用于基因组基因组文库文库构建的构建的载体载体通常选通常选装载量较大的装载量较大的l l-DNA或或考斯质粒考斯质粒；n对于大型基因组（如动植物和对于大型基因组（如动植

12、物和人类）需使用人类）需使用YAC载体载体n由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mRNA小于小于10 kb，因此用于因此用于cDNA文库文库构构建的载体通常选建的载体通常选质粒质粒 上述几种上述几种载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：质粒l l-DNA考斯质粒15 kb25 kb45 kbYAC400 kbn 用于基因文库构建的受体则根据载体使用于基因文库构建的受体则根据载体使用用大肠杆菌大肠杆菌或或酵母菌酵母菌密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆二、筛选：从基因文库中筛选目的基因从基因库中筛选特定的克隆从基因库中筛选特定的克隆 一个基因文库中有几万个克隆，目的基

13、因到底在哪个一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？克隆上呢？根据待选基因相关信息根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件。确定筛选方法和条件。最常用的方法是利用最常用的方法是利用DNADNA探针探针，用放射性同位素或非放用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因文库射性同位素标记探针，筛选基因文库 DNA探针（探针（probe）探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列 DNA DNA、cDNAcDNA、寡聚核苷酸寡聚核苷酸 单链、双链单链、双链 同位素标记、荧光标记、颜色标记同位素标记、荧光标记、颜色标记筛选文库筛选文库质粒基

14、因库筛选质粒基因库筛选细菌混合液在培细菌混合液在培养在平板上养在平板上转移到尼龙膜上转移到尼龙膜上裂解细菌裂解细菌变性变性DNADNA标记探针标记探针杂交杂交漂洗漂洗放射自显影或荧放射自显影或荧光检测光检测挑取对应菌落、挑取对应菌落、培养培养抽提质粒抽提质粒 阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定 u 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因分析、鉴定，才能最后得到目的基因 u 测序测序 自动测序仪自动测序仪u 功能分析功能分析 预测软件预测软件磷酸二脂键磷酸二脂键测序电泳图谱序列测定的技术序列测定的技术 杂交测序法杂交测序

15、法 质谱法质谱法 单分子测序法单分子测序法 原子探针显微镜测序法原子探针显微镜测序法DNA 芯片法芯片法 经典方法经典方法:Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技术方法新技术方法:连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级1、直接分离法“鸟枪法”二、筛选：从基因文库中筛选目的基因3、通过DNA合成仪直接合成目的基因从基因库中筛选特定的克隆基因组文库包含基因组的所有基因1、直接分离法“鸟枪法”一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。鸟枪法克隆目的基因的局限性

16、鸟枪法克隆目的基因的局限性基因组文库与 cDNA文库的比较：（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成目的基因受热变性，解旋；基因组文库 Genomic DNA library反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物；与与 PCR反应类似。反应类似。反应体系中包含：模板反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶酶,dNTPs,ddNTPs和测序和测序引物；引物；反应过程：反应过程：变性复性延伸终止变性复性延伸终止Sanger双脱氧终止法双脱氧终止法ddNTPs 是反应终止剂是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，可以当作正常碱基参与复制，一旦链入一旦链入DNA中，

17、其后就不能中，其后就不能再继续连接。再继续连接。反应体系中反应体系中dNTPs的浓度远高的浓度远高于于ddNTPs(一般一般1：34)。*少一个少一个OH脱氧核甘酸脱氧核甘酸与与双脱氧核甘酸双脱氧核甘酸结构比较结构比较荧光检测探头荧光检测探头电泳，看谁跑得快SangerSanger法测序产物的平均链法测序产物的平均链长取决于长取决于ddNTPddNTP：dNTPdNTP的比的比例，比例高时，得到较短例，比例高时，得到较短的产物；的产物；“标记终止法标记终止法”测序产物测序产物的平均长度可通过标记反的平均长度可通过标记反应中应中dNTPdNTP浓度浓度(高浓度能得高浓度能得到长的产物到长的产物)

18、或终止反应的或终止反应的ddNTP:dNTPddNTP:dNTP来调整。来调整。工作量较大，需要了解目的基因的背景知识的DNA片段或基因。根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件。（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成cDNA文库（cDNA library）重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1：34)。ddNTPs 是反应终止剂连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级可以当作正常碱基参与复制，一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识这些

19、序列分别与适当的载体结合在一起。载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆一基因文库概述 1、概念基因文库(library)：一套包含某生物体 所有基因的DNA序列。这些序列分别与适当的载体结合在一起。5、基因文库的质量标准 尽可能高的完备性重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构2 2、人工

20、合成基因法：、人工合成基因法：1 1）逆转录法：）逆转录法：mRNAmRNA双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因)逆转录酶逆转录酶单链单链DNADNA合成合成2 2）直接合成法：）直接合成法：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因（双链）目的基因（双链）化学合成化学合成三、基因文库的构建（一）切割：基因组DNA的分解 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！上述几种上述几种载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：质粒l l-DNA考斯质粒15 kb25 kb45 kbYAC400 kb