第九章-维生素医学课件.ppt

1、第九章第九章概概 述述维生素：维生素：是维持人体正常代谢机能所是维持人体正常代谢机能所必需的必需的 微量营养物资。微量营养物资。人体不能合成维生素。人体不能合成维生素。VitA、D2、D3、E、K1 等等 脂溶性脂溶性水溶性水溶性 VitB族族(B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、泛酸等。、叶酸、烟酸、泛酸等。分类分类按溶解度分按溶解度分 本章仅对维生素本章仅对维生素(A、B1、C、E)进行学习讨论进行学习讨论CH3CH3CH2ORCH3CH3CH3-H 维生素维生素A A醇醇-COCH3 维生素维生素A A醋酸酯醋酸酯-COC15H31 维生素维生素A A棕榈酸酯棕榈酸酯R:第一

2、节第一节 维生素维生素A为一个具有共轭多烯醇侧链的为一个具有共轭多烯醇侧链的 环己烯环己烯（一）（一）结构与性质结构与性质一、一、v 具有具有UV吸收吸收v 存在多种立体异构化合物存在多种立体异构化合物v 天然维生素天然维生素A主要是反式主要是反式v 易发生脱氢生成去氢维生素易发生脱氢生成去氢维生素A2v 易脱水生成去水维生素易脱水生成去水维生素A3v 易聚合反应生成无活性维生素易聚合反应生成无活性维生素A A酸醛环氧化物、氧化剂紫外线、VitAVitAVitAO2v 或有金属离子存在时更易氧化或有金属离子存在时更易氧化共轭多烯侧链共轭多烯侧链 易被氧化易被氧化（二）（二）环氧化物环氧化物OC

3、H2OHVitA醛醛HOCVitA酸酸COOH（三）（三）、与三氯化锑发生呈色反应、与三氯化锑发生呈色反应（四）（四）、溶解性、溶解性不溶于水不溶于水易溶于有机溶剂和植物油等易溶于有机溶剂和植物油等紫紫红红蓝蓝色色 3SbClVitACHCl3三氯化锑反应三氯化锑反应（一）（一）条件条件 无水无醇无水无醇紫紫红红蓝蓝色色 3SbClVitACHCl3 鉴别试验鉴别试验二、二、-RCOOSbCl5+CH2蓝色蓝色紫红紫红+CH2-RCOOSbCl5VitAVitA去水盐酸溶液溶解无水乙醇-300-400nm扫描扫描max为为326nm一个吸收峰一个吸收峰UV法法（二）（二）300-400nm扫描

4、扫描384、367、389nm三个吸收峰三个吸收峰去水去水VitA（VitA3）CH2CH3CH3CH2ORCH3CH3CH3VitAUSP 显色剂显色剂 磷钼酸磷钼酸 规定斑点颜色和规定斑点颜色和Rf值值BP 对照品法对照品法 显色剂显色剂 三氯化锑三氯化锑TLC法法（三）（三）三、含量测定三、含量测定 目前各国药典均采用紫外分光光度法替目前各国药典均采用紫外分光光度法替代三氯化锑比色法代三氯化锑比色法（一）、紫外分光光度法（一）、紫外分光光度法 利用维生素利用维生素A A醇和其醋酸酯分子中具醇和其醋酸酯分子中具多烯共轭体系结构，在多烯共轭体系结构，在325325328nm328nm处处有选

5、择性吸收峰，故可进行含量测定。有选择性吸收峰，故可进行含量测定。立体异构体立体异构体氧化产物及光照产物氧化产物及光照产物合成中间体合成中间体去氢维生素去氢维生素A A（VitAVitA2 2）去水维生素去水维生素A A（VitAVitA3 3）均对测定均对测定有干扰，有干扰，故采用故采用三三点校正法点校正法1 1：测定原理，三个波长的吸收度，公：测定原理，三个波长的吸收度，公式计算校正吸收度，再计算含量。故式计算校正吸收度，再计算含量。故得名。该法的依据：得名。该法的依据：杂质的吸收在杂质的吸收在310340nm310340nm波长范围波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收内呈一条直线，且随

6、波长的增大吸收度减小；度减小；物质对光的吸收具有加和性。物质对光的吸收具有加和性。2 2 波长的选择：最大吸收波长，及两侧各波长的选择：最大吸收波长，及两侧各选一波长选一波长 第一法（等波长法）第一法（等波长法）1 1=328nm=328nm，1=316nm，1=340nm，=12nm VitA VitA的的 maxmax（328nm328nm）Ch.PCh.P用于测定维生素用于测定维生素A A醋酸酯醋酸酯 第二法（等吸收法）第二法（等吸收法）分别在分别在 1 1的两侧各选一点的两侧各选一点 A A 2 2=A A 3 3=6/7A=6/7A 1 1=325nm 325nm，2=310nm，3

7、=334nm Ch.P用于测定维生素用于测定维生素A醇醇 3.杂质的吸收杂质的吸收 对对V.A有影响的杂质主要有以下几种：有影响的杂质主要有以下几种：(1)V.A2 和和V.A3(2)维生素维生素A的氧化产物的氧化产物(3)维生素维生素A在光照下产生的无活性的聚合物在光照下产生的无活性的聚合物(4)维生素维生素A的异构体等。的异构体等。以上这些杂质在以上这些杂质在310nm-340nm的波长范围内有吸的波长范围内有吸收，干扰维生素收，干扰维生素A的测定。的测定。4.测定方法测定方法（1）第一法（直接测定法，适用于纯度高的）第一法（直接测定法，适用于纯度高的维生素维生素A醋酸酯醋酸酯环己烷溶解）

8、环己烷溶解）1）方法）方法 在在300、316、328、340、360nm测吸收测吸收度度 2）计算）计算 a.吸光系数吸光系数E1%1cm b.求效价（求效价（IU/g）：效价指每）：效价指每g供试品所含维生素供试品所含维生素的的A的国际单位数。的国际单位数。IU/g=c.求维生素求维生素A醋酸酯占标示量的百分含量醋酸酯占标示量的百分含量l CAE1%1cm1900E1%1cm100%L100WW1900DA%标示量）标示量（3）换算因子：）换算因子：4）A值的选择：值的选择：a.计算吸收度比值：与中国药典的吸收度比值相比计算吸收度比值：与中国药典的吸收度比值相比较，判断每个差值的绝对值是否

9、超过较，判断每个差值的绝对值是否超过0.02。b.判断法判断法 最大吸收波长在最大吸收波长在326-329nm之间，且之间，且5个波长下的个波长下的绝对值差值均不超过绝对值差值均不超过0.02时，可直接用时，可直接用328nm波波长处的测得的吸收度值求得吸收系数。长处的测得的吸收度值求得吸收系数。最大吸收波长在最大吸收波长在326-329nm之间，计算之间，计算5个波长下个波长下的绝对差值，如果有一个或几个超过的绝对差值，如果有一个或几个超过0.02，应按，应按以下的方法进行判断：以下的方法进行判断：v若（若（A328校正校正-A328）*100%/A328 所得的数值的绝对所得的数值的绝对

10、值在值在3.0%，则仍不用校正公式计算吸收度。可直，则仍不用校正公式计算吸收度。可直接用接用A328代入代入E=A/C.Lv若（若（A328校正校正-A328）*100%/A328 所得的数值所得的数值 在在-15.0%到到-3.0%，则应用，则应用A328校正校正代入代入E=A/C.Lv若（若（A328校正校正-A328）*100%/A328 所得的数值在小于所得的数值在小于-15%或大于或大于+3%，则不能用本法测定，应使用第，则不能用本法测定，应使用第二法。二法。如果最大吸收波长不在如果最大吸收波长不在326-329nm之间，也之间，也不能用本法测定。不能用本法测定。第一法的校正公式为：

11、第一法的校正公式为：A328校正校正=3.52（2 A328 A316-A340）（2）第二法（皂化法，适用于）第二法（皂化法，适用于维生素维生素A醇醇）1）方法）方法 精密称取一定量的供试品，加精密称取一定量的供试品，加KOH乙醇溶乙醇溶液后煮沸回流，得到的皂化液再经过提取、液后煮沸回流，得到的皂化液再经过提取、洗涤、滤过、浓缩和干燥等处理，最后用洗涤、滤过、浓缩和干燥等处理，最后用异丙醇溶解残渣并稀释成每异丙醇溶解残渣并稀释成每1ml中含维生素中含维生素A为为9-15个国际单位数的溶液，在个国际单位数的溶液，在300、310、325、334nm波长处测定吸收度，并确定最波长处测定吸收度，并

12、确定最大吸收波长（应为大吸收波长（应为325nm）。）。2）计算）计算 同第一法。见书同第一法。见书p250-2513）A值的选择值的选择如果最大吸收波长在如果最大吸收波长在323-327nm之间，之间，且且A300/A325比值比值0.73，按下法判断：，按下法判断：va.若（若（A325校正校正-A325）*100%/A325 所得的数值的绝所得的数值的绝 对值在对值在3%，可直接用，可直接用A325 代入代入E=A/C.Lvb.若（若（A325校正校正-A325）*100%/A325 所得的数值的绝所得的数值的绝 对值超过对值超过3%，则用应用，则用应用A325校正校正代入代入E=A/C

13、.L如果最大吸收波长不在如果最大吸收波长不在323-327nm之间，之间，或或A300/A325比值比值0.73，表示供试品中杂质含量太高，表示供试品中杂质含量太高，应采用色谱法将未皂化部分纯化再进行测定。应采用色谱法将未皂化部分纯化再进行测定。第二法的校正公式：第二法的校正公式：A325校正校正=6.815 A325 2.555A310-4.260A3346.讨论讨论 1）.吸收度校正方法：吸收度校正方法：维生素维生素A醋酸酯：直线方程法（代数法）醋酸酯：直线方程法（代数法）维生素维生素A醇：相似三角形法（几何法或醇：相似三角形法（几何法或6/7定位法）定位法）2）.在应用三点校正法时，除其

14、中一点是在最大在应用三点校正法时，除其中一点是在最大 吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会产生较大误差。因此，在测定之前务必要校正波产生较大误差。因此，在测定之前务必要校正波长，并可用全反式维生素长，并可用全反式维生素A进行测定，比较测定进行测定，比较测定结果和比值是否与对照品相符合，以进一步核对结果和比值是否与对照品相符合，以进一步核对波长是否准确。测定的样品不得少于两份。波长是否准确。测定的样品不得少于两份。7.应用示例应用示例 维生素维生素A胶丸、维生素胶丸

15、、维生素AD胶丸和维生胶丸和维生素素AD滴剂等均可采用本法测定。滴剂等均可采用本法测定。第一法第一法 第二法第二法测定对象测定对象 维生素维生素A A醋酸酯醋酸酯 维生素维生素A A醇醇方法方法 直接取样，测定直接取样，测定 皂化提取，测定皂化提取，测定溶剂溶剂 环己烷环己烷 异丙醇异丙醇 maxmax 328 nm 325 nm 328 nm 325 nm测定波长测定波长 5 5个个 4 4个个换算因数换算因数 1900 18301900 1830第一法与第二法的区别第一法与第二法的区别三氯化锑比色法三氯化锑比色法（二）（二）优点优点 简便简便 快速快速max 618nm620nm标准曲线法

16、标准曲线法 SbOClSbClOH32缺点缺点呈色不稳定呈色不稳定（5 10s内）内）水分干扰水分干扰与标准曲线温差与标准曲线温差1专属性差专属性差三氯化锑有腐蚀性三氯化锑有腐蚀性（二）（二）蓝色蓝色+3SbClVitA（三）高效液相色谱法（三）高效液相色谱法RP-HPLC同时测定人血清中同时测定人血清中VitA和和VitE的含量的含量1、仪器与分析条件：、仪器与分析条件：HPLC-UV、C18(3003.9 mm）、甲醇水（）、甲醇水（96：4）、流速：）、流速：1.2 ml/min、检测波长：检测波长：08min(330 nm),8 min后后(292 nm）内标：维生素内标：维生素A醋酸

17、酯醋酸酯 维生素维生素B1广泛分布于米糠、麦麸和广泛分布于米糠、麦麸和酵母中，具有维持糖代谢及神经传导与酵母中，具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能。主要用于治疗维生素消化的正常功能。主要用于治疗维生素B1缺乏症、多发性神经炎及胃肠疾病。缺乏症、多发性神经炎及胃肠疾病。第二节第二节 维生素维生素B1NSCH3CH2CH2OHNNH3CNH2CH2+氨基嘧啶环氨基嘧啶环CH2噻唑环噻唑环(季铵碱季铵碱)HClCl-嘧啶环的氨基、噻唑环的季铵嘧啶环的氨基、噻唑环的季铵 为两个碱性集团为两个碱性集团（一）（一）溶解性溶解性1、易溶于水，乙醇微溶，、易溶于水，乙醇微溶，乙醚不溶乙醚不溶2、水溶液呈

18、酸性、水溶液呈酸性（二）（二）UV共轭双键共轭双键max=246nm结构与性质结构与性质一、一、蓝色荧光硫色素环合开环并与嘧啶换上氨基噻唑环正丁醇铁氰化钾氧化 OH（三）（三）硫色素反应硫色素反应与生物碱沉淀剂与生物碱沉淀剂（碘化汞钾等）（碘化汞钾等）（四）生物碱沉淀反应（四）生物碱沉淀反应嘧啶环嘧啶环 噻唑环噻唑环 （五）氯化物特性（五）氯化物特性 本品为盐酸盐，呈氯化物的反应。本品为盐酸盐，呈氯化物的反应。荧荧光光消消失失蓝蓝色色荧荧光光硫硫色色素素正正丁丁醇醇）（环环合合 +HCNFeKOHNaOHVitB6321O OHChP鉴别试验鉴别试验二、二、（一）（一）硫色素反应硫色素反应CH

19、2NNH3CNH2CH3NNaSC2H4OHONNH3CNH2HClNSCH3C2H4OHCH2NaOHNNH3CNNNaSCH3C2H4OH-H2O硫色素硫色素SCH3C2H4OHNNH3CNNH 环合环合NNH3CNNSCH3C2H4OH H22HVitB1 4242HgIHBHgIK 淡淡黄黄H+2KIIIHIB2 红红色色H+白白色色硅硅钨钨酸酸 H+OH4WO12OHSiOB23222 白白色色扇扇形形苦苦酮酮酸酸 H+（二）（二）沉淀反应沉淀反应三、三、含量测定含量测定 +HClOClOBHClOHClClBAcHg）（喹那啶红亚甲蓝（紫红喹那啶红亚甲蓝（紫红天蓝）天蓝）（一）（一

20、）非水溶液滴定法非水溶液滴定法 ml/mg.nMcT861622733710 反应摩尔比为反应摩尔比为1：2UV法法（二）（二）片剂、注射剂片剂、注射剂=421%11cmE（每片）相当于标示量的（每片）相当于标示量的%=A=ECL规格规格g/片片g/100mlgChPWEA%cmD10011%100标示量标示量平均片重平均片重（每（每ml）相当于标示量的）相当于标示量的%=规格规格g/mlml%VEA%cm100110011标示量标示量稀释倍数稀释倍数（三）（三）硫色素荧光法硫色素荧光法1、荧光荧光硫色素硫色素异丁醇异丁醇铁氰化钾铁氰化钾1 1VitBNaOH通过与对照品荧光强度的比较即可测得

21、通过与对照品荧光强度的比较即可测得供试品含量供试品含量2、实验操作、实验操作 40 ml具塞试管具塞试管3支支对照品溶液对照品溶液5 ml；其中其中2支加入氧化试剂支加入氧化试剂3.0 ml，再迅速加入，再迅速加入异丁醇异丁醇20 ml，振摇。第三支试管中加入，振摇。第三支试管中加入3.5 mol/l的的NaOH，同法操作为空白。，同法操作为空白。另取三支试管加入对照品同法操作。另取三支试管加入对照品同法操作。各试管中加入无水乙醇各试管中加入无水乙醇2 ml，分取异丁醇，分取异丁醇，进行荧光测定。进行荧光测定。3、结果计算、结果计算52.0dSbA含量（微克）4、（1）灵敏度高，线性范围宽）灵

22、敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于）代谢产物不干扰，适用于 体液分析体液分析（3）该法适用于）该法适用于VitB1的制剂含量分的制剂含量分析析（4）可用）可用BrCN为氧化剂，反应定量为氧化剂，反应定量完全，适合于生物样本分析完全，适合于生物样本分析第三节第三节 维生素维生素C654321OOHHOO C OHHCH2OHL抗坏血酸抗坏血酸具有烯二醇结构；具有烯二醇结构；具有内酯环；具有内酯环；具具2个手性碳原子个手性碳原子具有旋光性具有旋光性1、易溶于水、易溶于水2、水溶液呈酸性、水溶液呈酸性结构与性质结构与性质一、一、（一）（一）溶解性溶解性O二烯醇结构二烯醇结构二酮基结构二酮

23、基结构二烯醇结构二烯醇结构（二）（二）还原性还原性OHOHCCOOCCCH2OHOOOO C OHHCH2OHCHHOCHOHCOCOCOONa HH+OH-有活性有活性有活性有活性无活性无活性OHOO C OHHCH2OHHOO显显色色糠糠醛醛衍衍生生物物糠糠醛醛酚酚类类脱脱水水 +H糖类的显色反应糖类的显色反应蓝蓝色色糠糠醛醛吡吡咯咯脱脱水水 +HVitC50结构与糖类相似结构与糖类相似（三）（三）具糖的性质具糖的性质OOHHOO C OHHCH2OH123456C3OH的的pKa=4.17C2OH的的pKa=11.57酸性酸性（四）（四）一元酸一元酸OOHHOO C OHHCH2OH12

24、3456L(+)抗坏血酸抗坏血酸活性最强活性最强手性手性C（C4、C5）（五）（五）光学活性光学活性*与碱反应与碱反应单钠盐单钠盐32CONa酮酮酸酸盐盐水水解解 NaOH（六）（六）水解性水解性弱碱中生成单钠盐，弱碱中生成单钠盐，强碱中水解强碱中水解OHOO C OHHCH2OHHOOHOO C OHHCH2OHNaOCOONaOCOCCHOHHOCHCH2OHNa2CO3NaOH七七 紫外吸收特性紫外吸收特性560E243nm1%1cm有最大吸收与氧化剂的反应与氧化剂的反应（一）（一）鉴别试验鉴别试验二、二、OHOO C OHHCH2OHHOCH2OHOOOO C OHH O去氢抗坏血酸去

25、氢抗坏血酸OVitC（银镜）（银镜）黑黑 AgAgNOVitC1、与、与AgNO3反应反应2、与、与2，6-二氯靛酚反应二氯靛酚反应无无色色二二氯氯靛靛酚酚，VitC62氧化型氧化型玫瑰红色玫瑰红色+H还原型还原型蓝色蓝色 OHOHNClHOClONClHOClOHH（玫瑰色）玫瑰色）（无色）（无色）3.3.其他氧化剂的反应其他氧化剂的反应：亚甲蓝或高锰酸钾亚甲蓝或高锰酸钾 试剂褪色试剂褪色碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜 砖红色沉淀砖红色沉淀磷钼酸磷钼酸 钼蓝钼蓝糖类的反应糖类的反应（二）（二）蓝色糠醛戊糖脱水三氯醋酸VitC或盐酸或盐酸50吡咯吡咯USPOO C OHHCH2OHHOOHCH2OH

26、OO C OHHHHOOCCOHO OCHOH3CH2OHH2O-CO2-H2OOCHN（蓝色）（蓝色）OCHO(糠醛糠醛)OCHOH3CH2OHCH戊糖戊糖NNH50(吡咯吡咯)UV（三）（三）BP0.01mol/L HClnmmax243 58554511E%cm 三、杂质检查三、杂质检查 1.1.溶液的澄清度与颜色：有色杂质溶液的澄清度与颜色：有色杂质 分光光度法分光光度法2.2.铁、铜离子：原子吸收分光光度法铁、铜离子：原子吸收分光光度法+IIVitCH去去氢氢抗抗坏坏血血酸酸2指示剂指示剂 淀粉指示液淀粉指示液原理原理1、碘量法碘量法（一）（一）含量测定含量测定四、四、OO C OH

27、HOOCH2OHHI2+OHOO C OHHCH2OHHOH+I 取本品约取本品约0.2g，精密称定，加新，精密称定，加新沸过的冷水沸过的冷水100ml与稀醋酸与稀醋酸10ml使溶使溶解，加淀粉指示液解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴，立即用碘滴定液（定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝）滴定，至溶液显蓝色，在色，在30秒内不褪。每秒内不褪。每1ml碘滴定液碘滴定液(0.1mol/L)相当于相当于8.806mg的的C6H8O6方法方法2、（1）酸性环境）酸性环境 d.HCl （2）新沸冷新沸冷H2O减慢减慢VitC被被O2氧化速度氧化速度讨论讨论3、（3）立即滴定）立即滴定 赶走水中赶走水

28、中O2减少减少O2的干扰的干扰（4）附加剂干扰的排除）附加剂干扰的排除片剂片剂 滑石粉滑石粉 过滤过滤注射剂注射剂 抗氧剂抗氧剂 丙酮丙酮甲醛甲醛Na2SO3 NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5 2，6-二氯靛酚钠滴定法法二氯靛酚钠滴定法法（二）（二）USPJP原理原理1、酚亚胺酚亚胺二氯靛酚二氯靛酚，-6 62 2VitCVitC空空样样二氯靛酚液二氯靛酚液空白空白样品样品VVHAcHPO 3自身指示终点法自身指示终点法蓝蓝色色玫玫瑰瑰红红 +OHH无无色色还还原原 方法方法2、（2）快速滴定）快速滴定 2min内内 （1）酸性环境）酸性环境 HPO3-HAc 稳定稳定VitC防止

29、其他还原性物质干扰防止其他还原性物质干扰（3）剩余比色测定）剩余比色测定 AVitC测二氯靛酚（定量过量）（定量过量）（测剩余染料）（测剩余染料）讨论讨论3、（4）缺点）缺点 需经常标定需经常标定贮存贮存一周一周不稳定不稳定干扰多干扰多 氧化力较强氧化力较强三、高效液相色谱法三、高效液相色谱法1、色谱条件、色谱条件2、标准溶液的制备、标准溶液的制备3、血浆样品的处理：酸性溶液沉淀蛋白法、血浆样品的处理：酸性溶液沉淀蛋白法4、方法学考察、方法学考察5、测定、测定36.3710570.12XYr=0.9995LOQ=1.0 g/mlRSDintra8.33%RSDinter4.36%Recover

30、yL=90.1%RecovereyM=95.4%RecoveryH=97.5%一、离子对一、离子对HPLC法测定多种维生素法测定多种维生素 以能溶解于甲醇和水的樟脑磺酸为以能溶解于甲醇和水的樟脑磺酸为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠为抗离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠为抗氧剂，采用氧剂，采用HPLC法同时测定多种法同时测定多种Vit的的含量含量1、色谱条件：、色谱条件：色谱柱、流动相、检测波长色谱柱、流动相、检测波长2、样品液的制备：、样品液的制备：水溶性水溶性Vit(配制内标苯酚配制内标苯酚IS、标准液、样品、标准液、样品液）液）脂溶性脂溶性Vit（配制标准液和样品液）（配制标准液和样品液）3、

31、测定：、测定：水溶性测定波长水溶性测定波长272 nm，脂溶，脂溶性测定波长性测定波长 280 nm4、计算、计算 外标法和内标法外标法和内标法1、Apparatus and Reagents 二元泵二元泵HPLCUV N2000Workstation Standards:2、Methods and ResultsChromatographic conditions:C18 column(2504.6,i.d.,5m)Mobile phase:0.05 mol/l KH2PO4-CH3CN(97:3)-A and B(methanol)in Gradient elution mode as f

32、ollowing:Detection wavelength:210 nmFlow rate:1.0 ml/minColumn temperature:Room temperature)10:90(:min10)40:60(:min20)10:90(:BABABA非水非水HPLC法同时测定法同时测定4种脂溶种脂溶性维生素性维生素VitA、VitD2、VitE、VitK11、仪器与试剂：、仪器与试剂：HPLC、UV、N2000工作站、工作站、对照品购自中检所对照品购自中检所2、分析方法：色谱条件（流动相乙腈甲醇、分析方法：色谱条件（流动相乙腈甲醇80：20），），ODS，溶液的制备，方法学考察，溶

33、液的制备，方法学考察3、结果与讨论：如何优选合适的流动相、结果与讨论：如何优选合适的流动相 苯并二氢吡喃醇苯并二氢吡喃醇VitE为二氢吡喃醇衍生物为二氢吡喃醇衍生物第五节第五节 维生素维生素EOHO OR1HOR2CH3名名 称称R1R2相对活性相对活性-生育酚生育酚-生育酚生育酚-生育酚生育酚-生育酚生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1*CH3COOCH3CH3CH3CH3CH3CH3H3CH3COdl生育酚醋酸酯生育酚醋酸酯结构与性质结构与性质一、一、苯环苯环+二氢吡喃环二氢吡喃环+饱和烃链饱和烃链1、溶解性、溶解性 易溶于乙醇、丙酮、易溶于乙醇、丙酮、乙醚等，水

34、中不溶乙醚等，水中不溶2、氧化性、氧化性 对氧十分敏感与光、对氧十分敏感与光、空气可被氧化为生育醌和生育空气可被氧化为生育醌和生育 酚二聚体酚二聚体3、UV284 nm4、乙酰化的酚羟基、乙酰化的酚羟基 易水解易水解O醌型化合物醌型化合物生育酚生育酚+or OHHVitE杂质，需检查杂质，需检查O生育红生育红（一）（一）硝酸反应硝酸反应橙红色橙红色鉴别鉴别二、二、75水解水解HNO3VitE生育酚生育酚OOCH3C16H33H3CCH3O（橙红色）（橙红色）生育红生育红CH3HOOCH3C16H33CH3H3C生育酚生育酚HNO3强氧化剂强氧化剂三氯化铁三氯化铁-联吡啶反应联吡啶反应（二）（二

35、）OCH3CH3CH3CH3CH3-COOC16H33KOHHOOCH3CH3CH3CH3C16H33OOH3CCH3OHCH3C16H33CH3CH3HOOCH3C16H33CH3H3C生育酚生育酚对对-生育醌生育醌+3FeO弱氧化弱氧化剂剂血红色血红色+23Fe3+2FeNNNN =41.045.5%cmE11max=284nmmin=254nm0.01%无水乙醇中无水乙醇中UV法法（三）（三）薄层板薄层板 硅胶硅胶G展开剂展开剂 环己烷环己烷-乙醚（乙醚（4 ：1）显色剂显色剂 硫酸（硫酸（105 5）VitE Rf =0.7-生育酚生育酚 Rf =0.5-生育醌生育醌 Rf =0.9T

36、LC法法（四）（四）2.游离生育酚游离生育酚 生生育育醌醌对对生生育育酚酚+3422CeCe 杂质检查杂质检查 三、三、原理原理:利用游离生育酚的还原性，可被硫酸铈定量氧化利用游离生育酚的还原性，可被硫酸铈定量氧化 根据消耗硫酸铈滴定液的体积来控制游离生育酚的限量根据消耗硫酸铈滴定液的体积来控制游离生育酚的限量。1.酸度酸度 以以NaOHNaOH滴定液（滴定液（0.1mol/L0.5ml0.1mol/L0.5ml）体积）体积控制。控制。nCMT （M生育酚生育酚=430.8）（ml/mg154.228.43001.0T 例例 取本品取本品0.10g，加无水乙醇，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺

37、试液溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸滴，用硫酸铈液（铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸）滴定，消耗硫酸铈液（铈液（0.01mol/L）不得过）不得过 1.0ml。%100WTV%限量限量2.15%15.2%1001.0002154.00.1%限量限量限量限量四、四、含量测定含量测定GC法（法定方法）法（法定方法）（一）（一）1、选择性好选择性好灵敏度高灵敏度高速度快速度快分离效能好分离效能好挥发性低、不挥发性低、不稳定、极性强稳定、极性强衍生化易受衍生化易受样品蒸气压限样品蒸气压限制制载气载气N2固定液固定液硅酮（硅酮（OV-17）担体担体硅藻土或高分子多孔小球硅藻土或高分子多孔小球柱温

38、柱温265检测器检测器氢火焰离子化检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标内标正三十二烷正三十二烷 n 500 R2VitE测定的色谱条件测定的色谱条件2、内标法加校正因子内标法加校正因子内标法内标法供试液（样品供试液（样品+内标）内标）内标物内标物对照液（对照对照液（对照+内标）内标）是样品中不存在的物质是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近与被测组分峰靠近能与各组分完全分离能与各组分完全分离与被测组分的量接近与被测组分的量接近1KAA 内内对对2KAA 内内样样WWKK%VitE%10012 稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数样样对对实际工作中的计算方法实际工作中的计算方法（二）（二）HPLC法

39、法 RP-HPLC法、甲醇水（法、甲醇水（49：1）、）、UV=292 nm、外标法定量、外标法定量 rxrHHmmg三、荧光分光光度法三、荧光分光光度法1、药物本身具有荧光、药物本身具有荧光2、溶剂产生的拉曼光谱影响测定方法的、溶剂产生的拉曼光谱影响测定方法的灵敏度和准确度灵敏度和准确度3、采用同步荧光扫描法测定，消除干扰、采用同步荧光扫描法测定，消除干扰同步荧光扫描法测定血清中同步荧光扫描法测定血清中VitE的含量的含量1、仪器、仪器2、样品液的制备、样品液的制备:样品测定管样品测定管U、标、标准管准管S、空白管、空白管B3、测定方法：测定、测定方法：测定Fu、Fs、Fb4、计算：、计算：

40、)/(0.4LmgFFFFVbsbuE公元前公元前35003500年年-古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来 的维的维A A。16001600年年-医生鼓励以多吃动物肝脏来治夜盲症。医生鼓励以多吃动物肝脏来治夜盲症。17471747年年-苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病，也就是后来的维苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病，也就是后来的维C C。18311831年年-胡萝卜素被发现。胡萝卜素被发现。19051905年年-甲状腺肿大被碘治愈。甲状腺肿大被碘治愈。19111911年年-波兰化学家丰克为维生素命名。波兰化学家丰克为维生素命名。19151915

41、年年-科学家认为糙皮病是由于缺乏某种维生素而造成的科学家认为糙皮病是由于缺乏某种维生素而造成的19161916年年-维生素维生素B B被分离出来。被分离出来。19171917年年-英国医生发现鱼肝油可治愈佝偻病，随后断定这种病是英国医生发现鱼肝油可治愈佝偻病，随后断定这种病是 缺乏维缺乏维D D引起的。引起的。维生素发展史维生素发展史19201920年年-发现人体可将胡萝卜转化为维生素发现人体可将胡萝卜转化为维生素A A。19221922年年-维维E E被发现。被发现。19281928年年-科学家发现维科学家发现维B B至少有两种类型。至少有两种类型。19331933年年-维维E E首次用于治

42、疗。首次用于治疗。19481948年年-大剂量维大剂量维C C用于治疗炎症。用于治疗炎症。19491949年年-维维B3B3与维与维C C用于治疗精神分裂症。用于治疗精神分裂症。19541954年年-自由基与人体老化的关系被揭开。自由基与人体老化的关系被揭开。19571957年年-Q10-Q10多酶被发现。多酶被发现。19691969年年-体内超级抗氧化酶被发现。体内超级抗氧化酶被发现。19701970年年-维维C C被用于治疗感冒。被用于治疗感冒。19931993年年-哈佛大学发表维生素哈佛大学发表维生素E E与心脏病关系的研究结果。与心脏病关系的研究结果。返 回练习与思考练习与思考AA型题

43、型题 1.1.维生素维生素B B1 1的鉴别方法是的鉴别方法是A.A.三氯化铁反应三氯化铁反应 B.B.硫色素反应硫色素反应 C.C.柯柏反应柯柏反应 D.D.与碱性酒石酸铜试液反应与碱性酒石酸铜试液反应 E.E.双缩脲反应双缩脲反应2.2.维生素维生素E E中国药典中国药典规定的含量规定的含量 测定方法为测定方法为A.A.非水溶液滴定法非水溶液滴定法 B.B.旋光法旋光法 C.HPLCC.HPLC法法 D.D.紫外分光法紫外分光法 E.GCE.GC法法BB型题型题 A A。亚硝基铁氰化钠反应。亚硝基铁氰化钠反应 B.B.硫色素反应硫色素反应 C.C.硝酸反应硝酸反应 D.D.三氯化锑反应三氯

44、化锑反应 E.E.硝酸银试液的反应硝酸银试液的反应 1.1.维生素维生素C C 2.2.维生素维生素E E 3.3.维生素维生素B B1 1 4.4.维生素维生素A AECBDXX型题型题 1.1.用碘量法测定的药物有用碘量法测定的药物有A.A.醋酸地塞米松醋酸地塞米松 B.B.丙酸睾酮丙酸睾酮 C.C.维生素维生素C C D.D.硫酸阿托品硫酸阿托品 E.E.维生素维生素C C注射液注射液返 回2.2.可用紫外分光光度法测定含量的可用紫外分光光度法测定含量的 药物有药物有A.A.维生素维生素A A丸剂丸剂 B.B.丙酸睾酮丙酸睾酮 C.C.维生素维生素A A D.D.硫酸阿托品硫酸阿托品 E

45、.E.维生素维生素B B1 1片片计算题计算题 维生素维生素A的紫外法含量测定，掌握教材的紫外法含量测定，掌握教材上的例题和练习题上的例题和练习题简答题简答题 简述碘量法测维生素简述碘量法测维生素C含量的原理及实含量的原理及实验注意事项。验注意事项。第四节第四节 维生素维生素DHOHHCH2CH3HHHCH3CH3CH3CH3维生素维生素D2骨化醇骨化醇一、结构与性质一、结构与性质HOHHCH2CH3HHCH3CH3CH3维生素维生素D3胆骨化醇胆骨化醇开环的甾体开环的甾体：具有甾类化合物的显色反：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。应，可用于鉴别。手性碳原子手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴

46、别。：具有旋光性，可用于鉴别。多烯多烯：可进行紫外检测。：可进行紫外检测。性质：性质：1、脂溶性、脂溶性2、不稳定性、不稳定性3、旋光性、旋光性4、显色反应、显色反应5、紫外吸收特性、紫外吸收特性二、鉴别试验二、鉴别试验1.显色反应显色反应醋酐醋酐-硫酸反应硫酸反应 D2 黄黄 红红 紫紫 绿绿 D3 黄黄 红红 紫、蓝绿紫、蓝绿 绿绿 三氯化锑反应三氯化锑反应 橙红色渐变粉红橙红色渐变粉红三氯化铁反应三氯化铁反应 橙黄色橙黄色二氯丙醇和乙酰氯反应二氯丙醇和乙酰氯反应 绿色绿色2.比旋度鉴别比旋度鉴别维生素维生素D D2 2维生素维生素D D3 3溶溶 剂剂 浓浓 度度 比旋度值比旋度值无水乙

47、醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇40mg/ml40mg/ml5mg/ml5mg/ml+102.5+102.5+107.5+107.5+105+105+112+112注意事项注意事项：应于容器开启：应于容器开启3030分钟内取样，分钟内取样，在溶液配制后在溶液配制后3030分钟内测定。分钟内测定。3.3.区别反应：区别反应：以以96%96%乙醇为溶剂，加乙醇和乙醇为溶剂，加乙醇和85%85%硫酸，硫酸，D D2 2显红色，在显红色，在570nm570nm处有最大吸收，处有最大吸收，D D3 3显黄色，显黄色，在在495nm495nm处有最大吸收。处有最大吸收。4.4.其他方法其他方法：TLCTLC、H

48、PLCHPLC、制备衍生物测熔点、制备衍生物测熔点三、杂质检查三、杂质检查维生素维生素D D2 2中麦角甾醇的检查中麦角甾醇的检查：加洋地黄：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置皂苷溶液，混合，放置18h18h不得发生浑不得发生浑浊或沉淀。浊或沉淀。前维生素前维生素D D的光照产物的光照产物四、含量测定方法四、含量测定方法 中国药典采用正相中国药典采用正相高效液相色谱法高效液相色谱法(NP-HPLC(NP-HPLC）测测定维生素定维生素D D的含量，定量方法为内标法，内标物为的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯邻苯二甲酸二甲酯二甲酸二甲酯。根据样品的具体情况按以下三个方法进行分析。根据样品的具体情况

49、按以下三个方法进行分析。第一法第一法：用于无维生素：用于无维生素A A醇及其它杂质干扰的情况，步醇及其它杂质干扰的情况，步骤如下：骤如下：1 1系统适用性试验：测定重复性和分离度。系统适用性试验：测定重复性和分离度。Vit D3对 照 品前 Vit D3反 式 Vit DVit D3速 甾 醇 DVit D3重 复 性前 Vit D3与 反 式 Vit D3Vit D3与 速 甾 醇 D3901h254nm365nmHPLC冷 却环 己 烷R大 于 1.0RSD小 于 2.0%峰：峰峰33固定相：硅胶固定相：硅胶流动相：正己烷流动相：正己烷-正正戊醇（戊醇（997：3）第二法第二法：用于有杂质

50、的干扰的情况，步骤如下：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下：1 1皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙 醚、制备供试液醚、制备供试液A A。2 2净化：供试液净化：供试液A A经液相色谱分离，准确收集含有维经液相色谱分离，准确收集含有维 生素生素D D及前维生素及前维生素D D混合物的全部流出液，制混合物的全部流出液，制 备成供试液备成供试液B B。固定相：固定相：ODSODS 流动相：甲醇流动相：甲醇-乙腈乙腈-水（水（5050：5050：2 2）3 3含量测定：取供试液含量测定：取供试液B B按第一法测定。按第一法测定。第三法第三法：用于经