实时荧光定量在临床医学中的应用课件.ppt
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1、实时荧光定量在临床医学中的应用实时荧光定量在临床医学中的应用罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断 病原体测定 肿瘤诊断 基因差异表达研究 主要内容PCRPCR与基因诊断技术与基因诊断技术4 基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病做出诊断的方法。Polymerase chain reaction(PCR),聚合酶链式反应,是一种DNA的快速扩增技术。1998年,荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术 实时荧光定量PCR技术,是指在反应体系中加入荧光标记,利用荧光信号积累实时检测
2、整个PCR过程,通过标准曲线对PCR终产物的分析,最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术,是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光染料:SYBR Green I、EVA Green,ResoLight 荧光探针:TaqMan、Hybridization Probes、Molecular Beacon6罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程LightCyclerLightCycler Real-Time PCR Platform Real-Time PCR Platform 超过十年的实时荧光超过十年的实时荧光 PCR 的技
3、术革新的技术革新 LightCycler 1.0Instrument32 320 Sample number Detection channels Sample volume l LightCycler 2.0Instrument32 620/100 LightCycler 1536Instrument1536 2 0.5 2 l1998199820032003 200920092005/20082005/2008 LightCycler 480 Instruments(I,II)96/384 5/610-100/5-20 Astronaut 1与其它方法相比,具有高特异性、高灵敏度与方便快捷
4、的优点;Changes in expression pattern before and after trip to the ISS(RealTime ready GPCR panel)roche-applied-science.与其它方法相比,具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点;在最大的成神经细胞瘤库(n=579)中建立、验证了大量的预后多基因表达。Others:2 weeksClin Chem.及时调整:适时调整用药方案,防止因耐药而导致病情恶化4%,1:25Thiel,LMU Munich/Germany;Unpublished results,publication in prep
5、aration原先血中HBV DNA阳性,已痊愈超过12个月的血清凝血因子VIII的突变检测性病相关病原体(CT、NG、UU、HPV)的基因检测基因扫描高分辨率熔解分析qPCR图谱作为成神经细胞瘤指纹Predicting outcomes for children with neuroblastoma using a multigene-expression signature.荧光定量PCR技术的优点使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)及时调整:适时调整用药方案,防止因耐药而导致病情恶化治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类:L
6、ightCycler 480 LightCycler 480 广泛的应用广泛的应用 绝对定量绝对定量相对定量相对定量基于熔解曲线的基因分型基于熔解曲线的基因分型终点法基因分型终点法基因分型ATATAAAATTTT基于基于HRMHRM的突变扫描的突变扫描罗氏应用科学部在临床诊断的整体解决方案基因诊断 病原体测定病原体测定 定性分析定性分析 绝对定量绝对定量 耐药性研究耐药性研究 肿瘤诊断 基因差异表达研究 主要内容荧光定量荧光定量PCRPCR技术的临床应用技术的临床应用10 病毒性肝炎(HBV、HBV-YMDD、HCV)的基因检测 性病相关病原体(CT、NG、UU、HPV)的基因检测 优生优育项
7、目诊断:人巨细胞病毒(HCMV)、单纯疱疹病毒II型(HSV)、风疹病毒 其它病原体检测:结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等HBV DNAHBV DNA检测缩短检测缩短“窗口期窗口期”11PCR检测“窗口期”核酸检测缩短的“窗口期”的天数HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断荧光定量荧光定量PCRPCR方法检测方法检测HBVHBV感染的各期感染的各期12血清标本Copies/mlHBeAg阳性慢性乙型肝炎病人经干扰素治疗后HBeAg转阴非活动性HBsAg携带者血清原先血中HBV DNA阳性,已痊愈超过12个月的
8、血清乙肝的治疗乙肝的治疗13n 治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类:干扰素:重组人-1b干扰素、-2a、-2b干扰素等 核苷类似物:拉米夫定、阿德福韦。HBsAgHBsAg和和HBeAgHBeAg均阳性而均阳性而HBV DNAHBV DNA阴性?阴性?14 干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变,此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。抗病毒治疗中存在的问题抗病毒治疗中存在的问题 逆转录酶催化中心逆转录酶催化中心YMDDYMDD变变异异15 YMDD:酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门
9、冬氨酸 蛋氨酸(M)突变为异亮氨(I)或纈氨酸(V)形成YIDD变异株或YVDD变异株HBV-YMDDHBV-YMDD变异检测的临床意义变异检测的临床意义16 动态检测:服用拉米夫定3个月开始,每月检测1次 提前发现:可在耐药临床表现发生前1-4个月检测出突变株 及时调整:适时调整用药方案,防止因耐药而导致病情恶化HRMHRM的应用介绍的应用介绍用用12 12 个个MIRUVNTR MIRUVNTR 位点对位点对结核杆菌菌株结核杆菌菌株进行基因分型进行基因分型Yu Pang et al Journal of Microbiological Methods 2011in press不同不同MIR
10、U40 MIRU40 位点重复标准品的位点重复标准品的HRM HRM 分析结果分析结果.R=repeat.R=repeat8888个菌株不同个菌株不同MIRU40 MIRU40 数量的数量的Tm Tm 值的统计值的统计流行病学研究流行病学研究小结小结18 荧光定量PCR可以对致病微生物核酸含量进行定量检测 弥补免疫检测的缺陷(如HCV)缩短诊断的窗口期(如HIV),利于早期诊断 对治疗过程进行疗效监测 指导用药过程及剂量,以制定合理的疗效方案 结合临床表现,并与传统的免疫学、影像学等诊断方法来综合评判,更为科学。在特定条件下,譬如许多发育相关基因,在发育的特殊阶段去甲基化表达10,663-67
11、1.及时调整:适时调整用药方案,防止因耐药而导致病情恶化HRM法检测KRAS基因的敏感性结果Astronaut 4都为绿色荧光染料,最佳激发波长范围440-470nm,发射荧光波长470-520nm。非活动性HBsAg携带者血清序列的变化会导致熔解曲线的显著变化Data kindly distributed from Dr.抑癌基因与修复基因的甲基化导致抑癌基因沉默与修复基因失活;而总体低甲基化使反转录转座子、癌基因活化和染色体不稳定no separation of homozygous variantOthers:2 weeksGPCRs通过cMAP介导的信号通路影响免疫学功能乳腺癌早期诊断
12、(荧光定量PCR法):通过对外周血细胞的表达谱进行人类全基因组的表达差异分析,筛选乳腺癌早期诊断的基因标记物,采用实时荧光定量PCR技术,检测临床血液样本中乳腺癌标志物的表达差异,检测结果可用于乳腺癌的早期筛查和辅助诊断。ResoLight、LCGreen、EvaGreen缩短诊断的窗口期(如HIV),利于早期诊断病毒性肝炎(HBV、HBV-YMDD、HCV)的基因检测Changes in expression pattern before and after trip to the ISS(RealTime ready GPCR panel)罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程(2
13、009),Clinical Biochemistry 42,500-509.在最大的成神经细胞瘤库(n=579)中建立、验证了大量的预后多基因表达。罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断 病原体测定 肿瘤诊断肿瘤诊断 突变检测突变检测个性化用药个性化用药 甲基化 基因差异表达主要内容高分辨率熔解曲线高分辨率熔解曲线定义定义高分辨率熔解曲线高分辨率熔解曲线(HRM)(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR仪器与专门的分析算法 分辨率高,可以区分一个碱基突变的多组核酸样本,可以区分野生型(纯合子)、突变型(纯合子),杂合子
14、 使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)与其它方法相比,具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点;而且通量更高,单次成本更低!HRMHRM的应用的应用 SNP SNP 位点的检测位点的检测 (已知与未知位点已知与未知位点)单倍型分析,杂合性丧失的筛查单倍型分析,杂合性丧失的筛查,种群中优势等位基因分析,物种群中优势等位基因分析,物种鉴定种鉴定,DNA,DNA遗传作图,潜在易感基因的筛选遗传作图,潜在易感基因的筛选 医学应用:产前诊断,传染病与遗传疾病的监控,药物疗效的观察医学应用:产前诊断,传染病与遗传疾病的监控,药物疗效的观察 突变,包括小
15、片段的插入和缺失突变,包括小片段的插入和缺失 医学应用:肿瘤的快速诊断医学应用:肿瘤的快速诊断,治疗与预后评价治疗与预后评价 甲基化应用甲基化应用 医学应用:肿瘤的快速诊断医学应用:肿瘤的快速诊断,治疗与预后评价治疗与预后评价饱和荧光染料饱和荧光染料创新的饱和荧光染料创新的饱和荧光染料能够识别单碱基突变能够识别单碱基突变,并且不抑制并且不抑制PCRPCR反应反应不饱和双链不饱和双链DNADNA荧光染料荧光染料SYBR Green ISYBR Green I纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同饱和双链饱和双链DNADNA荧光染料荧光染料ResoLightResoLig
16、ht、LCGreenLCGreen、EvaGreenEvaGreen都为绿色荧光染料,最佳激发波长范围都为绿色荧光染料,最佳激发波长范围440-440-470nm470nm,发射荧光波长,发射荧光波长470-520nm470-520nm。序列的变化会导致熔解曲线的显著变化序列的变化会导致熔解曲线的显著变化纯合子纯合子杂合子杂合子VSVSvsvs创新的创新的HRM染料准确区分野生型纯合子和杂合子染料准确区分野生型纯合子和杂合子LC480 HRM Master Mix ResoLight Dye SYBR Green I vsLightCycler 480 ResoLight Dye后者提供更高的
17、信号灵敏度和分后者提供更高的信号灵敏度和分辨率辨率24HRMHRM技术和技术和dHPLCdHPLC的分辨率比较的分辨率比较dHPLCdHPLCHRMHRMwtmuthetwtwtwtwtwtmutmutmutmutmutwthetno separation ofno separation of homozygous homozygous variantvariant FAB Ex15J,318 bp amplicon,SNP A/GPCRPCR产物的高分辨率熔解曲线产物的高分辨率熔解曲线基于基因扫描的基因分型基于基因扫描的基因分型DNA withheterocygoteSNPPCR+.TCTT
18、TTTCCCCCGAAAAAAGGGGGDenaturationreannealing+IntercalatingfluorescentdyeIncreasingtemperature26Melting CurvesTemperatureCGTA两种同源双链两种同源双链两种异源双链两种异源双链CATG观察到的观察到的4 4种种双链结构双链结构杂合子扩增杂合子扩增基因基因扫描扫描高分辨率熔解分析高分辨率熔解分析 纯合子野生型(homoduplexes)纯合子突变 型(homoduplexes)杂合子案例:LPLH3基因的突变(SNP CT)72样品,PCR产物大小164 bpLightCycle
19、rLightCycler 480 HRM 480 HRM 应用介绍应用介绍基因扫描基因扫描 显著降低测序成本显著降低测序成本 甘露糖结合凝集素MBL2基因序列变异分析(384 个样本,扩增子长度219 bp):4种最常见的基因型在图像上被分为4组;少量样本呈现另外的3种遗传变异抑癌基因与修复基因的甲基化导致抑癌基因沉默与修复基因失活;而总体低甲基化使反转录转座子、癌基因活化和染色体不稳定荧光定量PCR技术的优点Astronaut 5European Space Agency Mission 欧洲航天计划 宇航员的基因表达在太空旅行前后是否有变化?Astronaut 4qPCR图谱作为成神经细胞
20、瘤指纹Predicting outcomes for children with neuroblastoma using a multigene-expression signature.1998年,荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。4%,1:25在特定条件下,譬如许多发育相关基因,在发育的特殊阶段去甲基化表达GPCRs通过cMAP介导的信号通路影响免疫学功能核苷类似物:拉米夫定、阿德福韦。及时调整:适时调整用药方案,防止因耐药而导致病情恶化Others:2 weeks性病相关病原体(CT、NG、UU、HPV)的基因检测Changes in expression pattern be
21、fore and after trip to the ISS(RealTime ready GPCR panel)荧光染料:SYBR Green I、EVA Green,ResoLight动态检测:服用拉米夫定3个月开始,每月检测1次基因扫描高分辨率熔解分析凝血因子VIII的突变检测这种新的半定量基因分型方法具有高灵敏度,是大型分子流行病和临床研究的理想工具。HRM技术和dHPLC的分辨率比较特异性强:直接扩增特异DNA或异常基因片段基于甲基化特定标志物的量化情况,对不同的病人进行风险水平分级P1R1R2R3P1R1R2R3P1R1R2R3P1R1R2R3GST基因缺失的多样性对于多因子疾病,
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