免疫学技术和临床-课件.ppt
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- 免疫学 技术 临床 课件
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1、2内容摘要内容摘要3什么是免疫分析的表现什么是免疫分析的表现4免疫检测的分析表现免疫检测的分析表现准确性准确性精密度精密度灵敏度灵敏度特异性特异性检测线性范围检测线性范围试剂稳定性试剂稳定性定标周期定标周期开瓶效期开瓶效期5免疫分析检测的临床表现免疫分析检测的临床表现临床灵敏度和特异性是分析结果准确性的临床表现临床灵敏度和特异性是分析结果准确性的临床表现:理想状态理想状态健康人群健康人群疾病人群疾病人群灵敏度灵敏度 100%100%特异性特异性 60%60%特异性特异性 100%100%灵敏度灵敏度 50%50%灵敏度增加灵敏度增加 特异性增加特异性增加假阴性假阴性 假阳性假阳性Cut-off
2、Cut-off设置设置cutoffcutoff值在此处值在此处用于筛查分析用于筛查分析设置设置cutoffcutoff值在此处值在此处减少错误诊断带来的高花费减少错误诊断带来的高花费设置设置cutoffcutoff值在此处值在此处为了最少化错误结果为了最少化错误结果6关于分析试剂的检测灵敏度的定义关于分析试剂的检测灵敏度的定义和仪器和仪器7分析表现特点分析表现特点:正常人群参考值和正常人群参考值和10%CV10%CV(功能灵敏度)(功能灵敏度)Histogram of Normal Subjects(N=254)3744874619981111001020304050607080901000-
3、0.0010.001-0.0050.005-0.010.01-0.0150.015-0.020.02-0.0250.025-0.030.03-0.0350.035-0.040.04-0.0450.045-0.050.05AccuTnI(ng/ml)Number of ObservationsFunctional Sensitivity=0.032 ng/mlFunctional Sensitivity(Concentration is 0.032ng/ml w hen CV=20%)0204060801001200.0010.0100.1001.000AccuTn I Concentratio
4、n(ng/ml)Total%CV0.0328免疫分析的基本概念免疫分析的基本概念9免疫分析的经典定义免疫分析的经典定义免疫分析(免疫分析(ImmunoassayImmunoassay)是一种技术用于检测和是一种技术用于检测和/或定或定量量 Y抗体(抗体(Antibody)通过一个特殊的只能和被分析物结合的抗体通过一个特殊的只能和被分析物结合的抗体抗原(抗原(Antigen)10作为免疫反应,抗原抗体的选择是整作为免疫反应,抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键个免疫分析特异性和总体表现的关键如何选择好一个抗体去检测一个被检如何选择好一个抗体去检测一个被检物质,而不与非常相似结构的其
5、它物物质,而不与非常相似结构的其它物质有交叉反应,或漏掉须反应的物质质有交叉反应,或漏掉须反应的物质,这是分析设计的重中之重,这是分析设计的重中之重抗体的量必须恰当,过多会引起复合抗体的量必须恰当,过多会引起复合物的溶解物的溶解11关于抗体的亲合力关于抗体的亲合力抗体除了要求纯度外(单价特异性)还必须要求抗体除了要求纯度外(单价特异性)还必须要求亲合力,效价指抗体的量,亲合力指抗体的质亲合力,效价指抗体的量,亲合力指抗体的质在非竞争免疫反应的方式中抗体亲和力比标记物在非竞争免疫反应的方式中抗体亲和力比标记物的最低检测极限更能影响分析的灵敏度的最低检测极限更能影响分析的灵敏度在竞争法免疫反应的方
6、式中抗体亲和力直接关系在竞争法免疫反应的方式中抗体亲和力直接关系到竞争的结果到竞争的结果对于样品中的干扰物质对于样品中的干扰物质,亲合力影响分析的抗干亲合力影响分析的抗干扰的能力扰的能力12免疫分析的工作定义免疫分析的工作定义免疫分析免疫分析(Immunoassay)(Immunoassay)是一种测试方式是一种测试方式,使用特使用特殊的抗体与被检测物质的结合殊的抗体与被检测物质的结合,此被检测物质不能通此被检测物质不能通过简单的化学方法所容易检测到的过简单的化学方法所容易检测到的.通常在检测系统中会使用到一种叫标记物(通常在检测系统中会使用到一种叫标记物(labelinglabeling)的
7、物质)的物质,常标记在抗体上常标记在抗体上通常会有一个分离(通常会有一个分离(separationseparation)的过程在最后读)的过程在最后读取信号前取信号前总是需要去仔细关注一下分析的方式(总是需要去仔细关注一下分析的方式(formatformat)13Access Access 的技术的技术免疫分析免疫分析 -“what-“what检测技术检测技术 化学发光化学发光 分离技术分离技术 磁性颗粒磁性颗粒 分析方式分析方式 灵活灵活 -“how-“how 分析方式分析方式检测技术检测技术分离技术分离技术14检测技术检测技术免疫分析免疫分析检测技术检测技术(Detection)(Dete
8、ction)有许多可用的有许多可用的方法方法 应用一些应用一些“标记物标记物 所产生的一些能所产生的一些能量进行测定量进行测定标记物可以或可以不被激活而产生能量标记物可以或可以不被激活而产生能量通过一些相应的检测器对标记物产生的能通过一些相应的检测器对标记物产生的能量进行测定量进行测定分离技术分离技术 分析方式分析方式 15放射免疫分析放射免疫分析(Radioimmunoassay)(Radioimmunoassay)优势优势优秀的灵敏度优秀的灵敏度较宽的检测线性范围较宽的检测线性范围局限性局限性标记物的半衰期短标记物的半衰期短试剂效期短试剂效期短检测结果的重现性差检测结果的重现性差每次检测都
9、要做标准曲线每次检测都要做标准曲线分析的反应时间长,半天分析的反应时间长,半天22天天发射性污染有害发射性污染有害很难实现自动化检测很难实现自动化检测16荧光荧光荧光素荧光素(FluorophoresFluorophores)FIA)FIA,DELFIADELFIA原理原理荧光底物荧光底物,4-MUP,4-MUP,或荧光标记物,镧系元素,或荧光标记物,镧系元素Eu3+,Tb3+,Sm3+Eu3+,Tb3+,Sm3+吸收光为一个短波长的光,而发射光为一个长波吸收光为一个短波长的光,而发射光为一个长波长的光长的光通过荧光计检测通过荧光计检测优势优势与与RIARIA具有相似的灵敏度和检测线性范围具有
10、相似的灵敏度和检测线性范围避免了避免了RIARIA对危害污染物处理的麻烦和半衰期短的对危害污染物处理的麻烦和半衰期短的问题问题局限性局限性可能会有来自样品中的一些自身荧光物质或短寿可能会有来自样品中的一些自身荧光物质或短寿命的荧光物质的干扰命的荧光物质的干扰需用空白对照,速率法或推迟读数来克服需用空白对照,速率法或推迟读数来克服17酵酵-颜色的变化颜色的变化酵酵(Enzymes)-EIA(Enzymes)-EIA原理原理在免疫分析结束后通过催化所加入的酵底物在免疫分析结束后通过催化所加入的酵底物典型的催化反应包括颜色的变化典型的催化反应包括颜色的变化,用分光光度计进用分光光度计进行检测行检测优
11、势优势非常容易使用的技术用于一些定性的分析非常容易使用的技术用于一些定性的分析局限性局限性对定量分析所要求的灵敏度和宽线性难以实现对定量分析所要求的灵敏度和宽线性难以实现ELISAELISA技术必须每次定标技术必须每次定标试剂部分成分要复溶重组试剂部分成分要复溶重组反应时间较长反应时间较长18化学发光化学发光化学发光物质化学发光物质 -CLEIA-CLEIA原理原理不稳定的分子通过加入一些化学基团变得很稳定不稳定的分子通过加入一些化学基团变得很稳定,而移去这些起稳定作用的化学基团后而移去这些起稳定作用的化学基团后,分子结构分子结构变得不稳定发出光(变得不稳定发出光(pHpH的改变,酵切作用,电
12、激的改变,酵切作用,电激发等)发等)优势优势 具备具备RIARIA所拥有的优势所拥有的优势(灵敏度和宽线灵敏度和宽线性性),),但排除其缺点但排除其缺点用一个简单的光度计读数用一个简单的光度计读数非常低的背景干扰非常低的背景干扰类型类型 闪烁闪烁(flash),(flash),持续持续(glow)(glow)发光发光发光物质的稳定性发光物质的稳定性水溶液中的稳定性水溶液中的稳定性19化学发光物质化学发光物质AMPPD,AMPPD,DioxetaneDioxetane(Lumi-PhosLumi-Phos 530TM)-530TM)-最稳最稳定的化学发光物质(第三代)定的化学发光物质(第三代)第
13、一代:鲁米那第一代:鲁米那第二代:丫啶酯类,三联第二代:丫啶酯类,三联 啶钌啶钌代表性分析系统代表性分析系统贝克曼库尔特贝克曼库尔特 -Access/Access 2/DxI800-Access/Access 2/DxI800终点读数终点读数,更稳定更稳定RLU00 5 10 时间时间(分钟分钟)55 60 20 ACCESS ACCESS化学发光标记物的特点化学发光标记物的特点很宽的检测线性范围很宽的检测线性范围可检测到可检测到6 6个数量级个数量级(例如例如:1-100,000:1-100,000 units)units)极高的灵敏度极高的灵敏度可检测到小到可检测到小到10-21 10-2
14、1 摩尔摩尔/升升很底的背景干扰很底的背景干扰对于一些超敏分析项目对于一些超敏分析项目,有相当接近零值的背有相当接近零值的背景信号景信号更超强的试剂稳定性更超强的试剂稳定性试剂效期试剂效期开瓶效期开瓶效期定标周期定标周期21分离技术分离技术免疫分析免疫分析检测技术检测技术分离技术分离技术(Separation)(Separation)有很多方式有很多方式典型的是典型的是,特异性结合的分析物被保留而特异性结合的分析物被保留而未结合物质和无用的反应物被清除未结合物质和无用的反应物被清除 分析方式分析方式 22技术的创新技术的创新微粒子包被微粒子包被珠包被珠包被微孔包被微孔包被管包被管包被23磁颗粒
15、包被技术磁颗粒包被技术磁颗粒抗体包被技术磁颗粒抗体包被技术磁颗粒均匀的悬浮于整个反应体系磁颗粒均匀的悬浮于整个反应体系分析物在磁颗粒表面捕获分析物在磁颗粒表面捕获磁颗粒在磁场中被清洗磁颗粒在磁场中被清洗磁颗粒重新悬浮十分容易磁颗粒重新悬浮十分容易优势优势快速的反应动力学快速的反应动力学较少的样品量较少的样品量提高检测的灵敏度提高检测的灵敏度极好的批内重显性极好的批内重显性可以探针取放,实现自动化可以探针取放,实现自动化24分析方式分析方式免疫分析免疫分析检测技术检测技术分离技术分离技术 分析方式分析方式-有很多种方式有很多种方式可定义为分析的可定义为分析的“处方处方设置一个最优化的方式设置一个
16、最优化的方式(可变量可变量)去最优去最优化项目的临床应用化项目的临床应用 25分析方式分析方式可变量可变量夹心法夹心法(Sandwich)vs.(Sandwich)vs.竞争法竞争法(competitive)(competitive)标记物的放置标记物的放置同步同步(Simultaneous)vs.(Simultaneous)vs.分步分步(sequential)(sequential)试剂试剂/样品加入的顺序样品加入的顺序孵育的次数孵育的次数(步骤步骤)清洗分离的次数清洗分离的次数(步骤步骤)试剂试剂/样品的体积样品的体积/厚度厚度孵育的时间孵育的时间孵育的温度孵育的温度26Access A
17、ccess 的分析方式的分析方式基本分析方式基本分析方式夹心法夹心法(Sandwich)(Sandwich)竞争结合竞争结合(Competitive binding)(Competitive binding)试剂的加入,孵育和清洗试剂的加入,孵育和清洗 同步同步(Simultaneous)(1(Simultaneous)(1步步,1,1次清洗次清洗)分步分步(Sequential)(2(Sequential)(2步步,2,2次清洗次清洗)“Piggyback“Piggyback (2(2步步,1,1次清洗次清洗)27夹心法分析方式夹心法分析方式捕捉抗体捕捉抗体(Capture antibody
18、)(Capture antibody)和标记抗体和标记抗体(labeled antibody)(labeled antibody)每个不同的抗体可以针对不同的抗原决定每个不同的抗体可以针对不同的抗原决定簇,或二个在同一个抗原决定簇簇,或二个在同一个抗原决定簇分析更特异因为二个抗体同时反应分析更特异因为二个抗体同时反应适合于检测大分子物质适合于检测大分子物质bhCGbhCG TSH TSHIgEIgEProlactinProlactinFSHFSH LH LH FerritinFerritinHBsAgHBsAg28竞争法分析方式竞争法分析方式只有捕捉抗体只有捕捉抗体主要针对小分子物质检测主要针
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