临床微生物学和微生物学检验课件.ppt

1、第三章细菌感染病原性诊断第三章细菌感染病原性诊断 疾病的种类不断发生变迁，传染病如疾病的种类不断发生变迁，传染病如鼠疫等已明显减少，相反，由条件致病菌鼠疫等已明显减少，相反，由条件致病菌引起的内源性感染却明显增多。同时，新引起的内源性感染却明显增多。同时，新的病原菌不断出现，原有的病原菌因变异、的病原菌不断出现，原有的病原菌因变异、耐药等又重新流行。耐药等又重新流行。目前，临床遇到主要是条件致病菌目前，临床遇到主要是条件致病菌引起的感染。正常菌群与病原菌的致引起的感染。正常菌群与病原菌的致病性是相对的，因此，既不要轻易认病性是相对的，因此，既不要轻易认为分离出的非致病菌是污染菌，也不为分离出的

2、非致病菌是污染菌，也不要轻易认为所发现的细菌就是该感染要轻易认为所发现的细菌就是该感染的病原菌，必须结合临床进行进一步的病原菌，必须结合临床进行进一步的诊断。的诊断。第一节第一节 临床感染性疾病临床感染性疾病 实验诊断要求实验诊断要求 一、诊断的目的一、诊断的目的 1.1.以疾病的病原学诊断为目的以疾病的病原学诊断为目的,只需鉴只需鉴 定到细菌的种。定到细菌的种。2.2.为提供治疗方案为目的，要进行临为提供治疗方案为目的，要进行临 床标本的直接药物敏感试验。床标本的直接药物敏感试验。3.3.以流行病学研究为目的以流行病学研究为目的,要鉴定到型。要鉴定到型。4.4.以了解细菌与感染的关系为目的以

3、了解细菌与感染的关系为目的,应应 该做细致的鉴定。该做细致的鉴定。二、诊断试验的选择二、诊断试验的选择1.1.选择有鉴定价值的试验。选择有鉴定价值的试验。2.2.选择简易、快速、方便的试验，达选择简易、快速、方便的试验，达 到目的即可。到目的即可。3.3.综合考虑试验的敏感性和特异性。综合考虑试验的敏感性和特异性。敏感性敏感性=阳性结果数阳性结果数/感染病人数，感染病人数，越高假阴性就越少。越高假阴性就越少。特异性特异性=阴性结果数阴性结果数/未感染病人数，未感染病人数，越高假阳性就越少。越高假阳性就越少。评价某诊断试验的资料整理表评价某诊断试验的资料整理表n诊断试验诊断试验 病例病例 非病例

4、非病例 合计合计n阳性阳性 a(真阳性真阳性)b(假阳性假阳性)a+bn阴性阴性 c(假阴性假阴性)d(真阴性真阴性)c+dn合计合计 a+c b+d N灵敏度与特异度灵敏度与特异度n灵敏度是指在患者中用该试验检查得到阳性结果的百分比，它可衡量诊断试验正确地识别患某病的能力，亦称真阳性率.n an灵敏度(真阳性率）=x100%n a+c特异度n特异度是指在无病者中用该试验检获得阴性结果的百分比。n d 特异度(真阴性率）=x100%n b+dn灵敏度与特异度是评价一项诊断试验真实性灵敏度与特异度是评价一项诊断试验真实性的两个基本指标。从理论上讲，一项理想的的两个基本指标。从理论上讲，一项理想的

5、诊断试验其灵敏度、特异度最好均为诊断试验其灵敏度、特异度最好均为100%，即假阳性率与假阴性率均为零，无一漏诊与即假阳性率与假阴性率均为零，无一漏诊与误诊，但事实上难以达到，通常患病者与非误诊，但事实上难以达到，通常患病者与非患病者的测定值有重叠现象，灵敏度升高，患病者的测定值有重叠现象，灵敏度升高，则特异度降低，反之成立。则特异度降低，反之成立。三、常用诊断流程 1.1.双歧索引双歧索引用于相互区别比较有用于相互区别比较有特征的细菌，如革兰特征的细菌，如革兰阴性杆菌初步分群；阴性杆菌初步分群；对于相互区别较难的对于相互区别较难的细菌，鉴定项目较多细菌，鉴定项目较多,用起来不太方便。用起来不太

6、方便。2.2.表解法：表解法：将各种细菌及其多种特性列成矩阵表将各种细菌及其多种特性列成矩阵表格，使相互的区别点十分明显，便于格，使相互的区别点十分明显，便于分析比较。此法对于相互区别比较复分析比较。此法对于相互区别比较复杂的细菌，如肠杆菌科的初步分属。杂的细菌，如肠杆菌科的初步分属。书上书上1717页表页表2-12-13.3.数字编码鉴定法数字编码鉴定法 将所得生化反应模式转化成数学模式，可将所得生化反应模式转化成数学模式，可把细菌生化反应结果转化成数字，经检索手册把细菌生化反应结果转化成数字，经检索手册又可将转化成细菌名称。与电脑分析软件配套，又可将转化成细菌名称。与电脑分析软件配套，形成

7、了半自动或全自动细菌分析系统。数字编形成了半自动或全自动细菌分析系统。数字编码鉴定已有商品成套供应，由于操作简单、鉴码鉴定已有商品成套供应，由于操作简单、鉴定方法易于掌握，被临床实验室广泛使用。定方法易于掌握，被临床实验室广泛使用。组别试验项目代码结果结果代码总值 1硫化氢苯丙氨酸葡萄酸盐 4 2 1 -+0 0 11 2靛基质甲基红枸橼酸盐 4 2 1 -+0 2 13 3尿素动力产气 4 2 1+4 2 1 7 4赖氨酸鸟氨酸棉子糖 4 2 1+-4 2 0 6 5山梨醇侧金花醇木胶糖 4 2 1+-4 2 0 6第二节第二节 临床标本的采集临床标本的采集 与处理与处理 一、标本采集的一般

8、原则一、标本采集的一般原则 1.1.病程早期、急性期或症状典型时，使用抗病程早期、急性期或症状典型时，使用抗生素前。否则在培养时应加入拮抗剂。生素前。否则在培养时应加入拮抗剂。2.2.无菌采集：标本采集时应注意无菌操作，无菌采集：标本采集时应注意无菌操作，尽量避免杂菌污染。尽量避免杂菌污染。3.3.根据目的菌的特性用不同的方法采集根据目的菌的特性用不同的方法采集 适量标本，采集量不应过少。适量标本，采集量不应过少。4.4.注意在不同病程采集不同部位标本。注意在不同病程采集不同部位标本。5.5.采集标本时要防止传播和自身感染。采集标本时要防止传播和自身感染。二、标本的处理1.1.标本保存在标本保

9、存在44环境中，在环境中，在2h2h之内送检。之内送检。脑脊液则要在脑脊液则要在25 25 保存，用于细菌培保存，用于细菌培 养的标本保存时间不应超过养的标本保存时间不应超过24h24h。对环。对环 境敏感的细菌应保温并立即送检。境敏感的细菌应保温并立即送检。2.2.标本中可能含有致病菌，必须注意安全标本中可能含有致病菌，必须注意安全 防护。切勿污染环境。对于烈性传染病防护。切勿污染环境。对于烈性传染病 标本运送时更要由专人运送，严格按规标本运送时更要由专人运送，严格按规 定包装。定包装。3.3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽

10、取标本的注射器运送。有时可直接用抽取标本的注射器运送。4、标本做好标记，详细填写化验单，保证各环标本做好标记，详细填写化验单，保证各环节的准确无误节的准确无误 人体受致病菌感染后，其免疫系统被刺激后发人体受致病菌感染后，其免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异性抗体。抗体的量常随生免疫应答而产生特异性抗体。抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价（滴度）的升高。感染过程而增多，表现为效价（滴度）的升高。因此，用已知的细菌或其特异性抗原检测患者因此，用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应特异抗体和其效价的动态变化，体液中有无相应特异抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。一般

11、采取病人可作为某些传染病的辅助诊断。一般采取病人的血清进行试验，故称为的血清进行试验，故称为血清学诊断血清学诊断(serological diagnosis)(serological diagnosis)。第二节第二节 血清学诊断血清学诊断血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清标本，当后者的抗体效价比前者份血清标本，当后者的抗体效价比前者升高大升高大于等于于等于4 4倍倍时方有意义。时方有意义。常用方法：直接凝集试验、乳胶凝集试验、沉常用方法：直接凝集试验、乳胶凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、中和试验、淀试验、补体结合试验、中和试验、ELISA

12、ELISA。第三节第三节 细菌形态学检查细菌形态学检查 一、显一、显 微微 镜镜 1.1.普通光学显微镜用油镜放大普通光学显微镜用油镜放大10001000倍，一般细菌倍，一般细菌 均能清楚看到。均能清楚看到。2.2.暗视野显微镜用于检查不染色的活细菌和螺旋暗视野显微镜用于检查不染色的活细菌和螺旋 体的形态及运动观察。体的形态及运动观察。3.3.相差显微镜主要用于检查不染色活细菌的形态相差显微镜主要用于检查不染色活细菌的形态 及某些内部结构。及某些内部结构。4.4.荧光显微镜可看到发射荧光的细菌。还应用荧光显微镜可看到发射荧光的细菌。还应用 于免疫荧光技术中。于免疫荧光技术中。5.5.电子显微镜

13、有透射电子显微镜和扫描电子显电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显 微镜。前者适于观察细菌内部超微结构，后微镜。前者适于观察细菌内部超微结构，后 者适于对细菌表面结构及附件观察。者适于对细菌表面结构及附件观察。二、不染色细菌标本检查 1.1.主要用于检查生活状态下细菌的动力及运主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用压滴法和悬滴法。可对某些动状况。常用压滴法和悬滴法。可对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱菌。病原菌作出初步鉴定，如霍乱菌。2.2.螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。用不染色标本作暗视野显微镜检查。三、细菌染

14、色标本的检查三、细菌染色标本的检查 细菌标本经染色后，除能清楚看细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类。还可根据染色反应将细菌进行分类。(一一)常用染料常用染料 分为碱性和酸性两大类。此外，还有复分为碱性和酸性两大类。此外，还有复合染料。合染料。1 1碱性染料碱性染料 电离后显色离子带正电荷，电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌易与带负电荷的被染物结合。由于细菌 均带负电荷，易与染料结合而着色。常均带负电荷，易与染料结合而着色。常 用的有碱性复红、结晶紫、美蓝等。用的有碱性复红、结晶紫、美

15、蓝等。2 2酸性染料酸性染料 电离后显色离子带负电荷，电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。细菌都带有易与带正电荷的被染物结合。细菌都带有负电荷故不易着色。通常用来染细胞浆，负电荷故不易着色。通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。有伊红、刚果红等。3 3复合染料复合染料(中性染料中性染料)及荧光染料及荧光染料 复合染料是碱性染料和酸性染料的复合复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料物，如瑞氏染料(伊红美蓝伊红美蓝)、姬姆萨染、姬姆萨染料料(伊红天青伊红天青)等；荧光染料如荧光标记等；荧光染料如荧光标记的

16、抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。（二）常用的染色方法（二）常用的染色方法分为两种：单染色法和复染色法。分为两种：单染色法和复染色法。在细菌感染标本的检查中，临床上常用在细菌感染标本的检查中，临床上常用的复染色方法有革兰染色、抗酸染色和荧的复染色方法有革兰染色、抗酸染色和荧光染色。光染色。1 1革兰染色革兰染色最经典、最常用的染色方法。在分离最经典、最常用的染色方法。在分离培养前都要进行革兰染色、镜检。通培养前都要进行革兰染色、镜检。通过革兰染色将所有细菌分为过革兰染色将所有细菌分为G G+

17、菌和菌和G G-菌两大类，可初步识别细菌，有助于菌两大类，可初步识别细菌，有助于进一步鉴定。进一步鉴定。结合细菌特殊结构及排列方式，对病结合细菌特殊结构及排列方式，对病原菌可进行鉴定，其结果为临床早期诊断原菌可进行鉴定，其结果为临床早期诊断及治疗提供了依据。及治疗提供了依据。革兰染色可为临床选择用药提供参考，革兰染色可为临床选择用药提供参考，帮助临床制订有针对性的治疗方案。因为帮助临床制订有针对性的治疗方案。因为G G+菌和菌和G G-菌对抗生素敏感性不同，且致病菌对抗生素敏感性不同，且致病物质及其作用机理也不同。物质及其作用机理也不同。革兰染色革兰染色n（1）染色液：）染色液：1）结晶紫溶液

18、：结晶紫溶于）结晶紫溶液：结晶紫溶于95%乙乙醇中，然后与草酸铵溶液混合过滤制成；醇中，然后与草酸铵溶液混合过滤制成；2）碘液）碘液（卢戈碘液）：碘化钾和碘熔于蒸馏水制成；（卢戈碘液）：碘化钾和碘熔于蒸馏水制成；3）95%乙醇；乙醇；4）稀释石炭酸复红：取碱性复红酒精饱）稀释石炭酸复红：取碱性复红酒精饱和溶液和溶液10ml与与5%石炭酸溶液石炭酸溶液90ml混合制成石炭酸混合制成石炭酸复红液，再将其用蒸馏水做复红液，再将其用蒸馏水做10倍稀释即成。倍稀释即成。革兰染色革兰染色n（2）方法：）方法：1）涂片固定；）涂片固定；2）结晶紫初染）结晶紫初染1min，小水冲洗；，小水冲洗；3）碘液媒染）

19、碘液媒染1min，小水，小水冲洗；冲洗；3）95%乙醇脱色乙醇脱色30秒，小水冲洗；秒，小水冲洗；4）稀释复红复染稀释复红复染1min；吸干后镜检。；吸干后镜检。n（3）结果：）结果：革兰阳性菌：紫色；革兰阴性菌：革兰阳性菌：紫色；革兰阴性菌：红色；红色；革兰染色革兰染色n（4）原理：）原理：有以下几种学说：有以下几种学说：1）等电点学说：）等电点学说：G+的的等电点（等电点（PH23）比）比G-的等电点（的等电点（PH45）低，在）低，在同一同一PH条件下，条件下，G+比比G-所带电荷多，与带正电荷的所带电荷多，与带正电荷的碱性染料结合力牢固，不易脱色；碱性染料结合力牢固，不易脱色；2）化学

20、学说：）化学学说：G+含有大量核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘含有大量核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被牢固结合成大分子复合物，不易被95%乙醇脱色；而乙醇脱色；而G-含此种物质少，故易被乙醇脱色；含此种物质少，故易被乙醇脱色；革兰染色革兰染色n（4）原理：）原理：3）细胞壁结构学说：）细胞壁结构学说：G+细胞壁结构较致密，细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚并具有三维空间结构，脂类含量低，乙醇不易透肽聚糖层厚并具有三维空间结构，脂类含量低，乙醇不易透入，而且入，而且95%乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小、通透乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小、通透性降低，阻

21、碍结晶紫与碘的复合物渗出；而性降低，阻碍结晶紫与碘的复合物渗出；而G-细胞壁结构较细胞壁结构较疏松，肽聚糖层薄且无三维空间结构，含脂质量多，易被乙疏松，肽聚糖层薄且无三维空间结构，含脂质量多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物被溶出而脱色。目前认为，细胞壁结构与化学组成上的差物被溶出而脱色。目前认为，细胞壁结构与化学组成上的差异是染色反应不同的主要原因。异是染色反应不同的主要原因。2 2抗酸染色抗酸染色 将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两大类。因为大多数病原菌为非抗酸性，所大类。因为大多

22、数病原菌为非抗酸性，所以抗酸染色不作为常规检查项目。以抗酸染色不作为常规检查项目。只用于结核病等检查。抗酸染色的鉴只用于结核病等检查。抗酸染色的鉴定结果。对疾病的诊断和治疗具有重要参定结果。对疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。考价值。抗酸染色的方法抗酸染色的方法n是细菌着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法。抗酸性染色反应细菌为抗酸细菌，分枝杆菌属的细菌为抗酸性细菌。这些细菌一般染色方法不易着色，常采用抗酸染色。先用较高浓度的石炭酸复红（5%）染色，加温促使菌体着色，再加3%盐酸乙醇脱色，最后用美蓝复染，未脱色者呈红色为抗酸性细菌，脱色经复染呈蓝色的细菌为非抗酸性细菌。3 3荧光染色荧光染色 敏感性

23、强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。此外还有：此外还有：鞭毛染色鞭毛染色可观察有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，可观察有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中很重要。在细菌鉴定中很重要。异染颗粒染色异染颗粒染色镜检异染颗粒，为临床早期诊断镜检异染颗粒，为临床早期诊断提供依据（白喉杆菌中的异染颗粒）。提供依据（白喉杆菌中的异染颗粒）。芽孢染色：芽孢染色：可观察细菌芽孢的大

24、小、位置，从而鉴定细菌可观察细菌芽孢的大小、位置，从而鉴定细菌荚膜染色荚膜染色4、负染色法n是指将标本的背景着色而细菌不着色的染色方法。第四节细菌分离培养与接种技术第四节细菌分离培养与接种技术 绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长，绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长，细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感试验，才可对感染培养、鉴定和药物敏感试验，才可对感染性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。因此，细菌培养对疾病的诊断、预防和治因此，细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用。疗具有重要的作用。（一）细菌

25、室的符合条件（一）细菌室的符合条件1 1细菌室必须安装严密的门窗，以防室细菌室必须安装严密的门窗，以防室 内环境受到外界的污染。且室内禁用内环境受到外界的污染。且室内禁用 风扇，避免细菌的播散。风扇，避免细菌的播散。2 2细菌室必须安装供空气消毒的紫外线细菌室必须安装供空气消毒的紫外线 灯，置于操作台上面灯，置于操作台上面lmlm处，每天开始处，每天开始 工作前照射工作前照射 20min20min。对其消毒效果要。对其消毒效果要 定期检查，及时更换失效的灯管。定期检查，及时更换失效的灯管。3 3室内应备有消毒剂，用于试验中发生室内应备有消毒剂，用于试验中发生 菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还菌

26、液洒溅时的及时消毒处理。同时还 应备有供工作人员浸手用的盛有消毒应备有供工作人员浸手用的盛有消毒 剂的水盆、肥皂及自来水源等。剂的水盆、肥皂及自来水源等。4 4室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地 面至少一周用消毒剂擦洗面至少一周用消毒剂擦洗1 1次。次。5 5对接收的标本、无菌器具、用过的物对接收的标本、无菌器具、用过的物 品等应明显分开井放在指定位置。同品等应明显分开井放在指定位置。同 时要对用过的物品及时进行灭菌处理。时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6 6细菌室应有根据当地的气温特点可安装细菌室应有根据当地的气温特点可安装 空调机，还需有消防设备。空调机，还

27、需有消防设备。(二二)无菌实验室无菌实验室1 1无菌室应完全封闭，人员出入应无菌室应完全封闭，人员出入应 有两道门，其间应隔有缓冲区。有两道门，其间应隔有缓冲区。2 2用前应以紫外线消毒用前应以紫外线消毒30min30min，定期，定期 用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。3 3在无菌室中一般仅限于分装无菌的在无菌室中一般仅限于分装无菌的 培养基及传染性强的细菌的接种，培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。不进行有菌标本的分离及其他操作。4 4无菌室内应仅限操作人员进人，而且无菌室内应仅限操作人员进人，而且 进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操进入无菌室

28、应着隔离衣和专用鞋，操 作时戴口罩，随时保证室内的无菌状作时戴口罩，随时保证室内的无菌状 态。态。5 5条件有限的实验室，可用超净工作台条件有限的实验室，可用超净工作台 代替无菌实验室进行相应的操作。超代替无菌实验室进行相应的操作。超 净工作台应选择垂直气流通风方式。净工作台应选择垂直气流通风方式。6 6无菌室应配备空调设备，保证不因室无菌室应配备空调设备，保证不因室 温而影响工作。温而影响工作。(三三)基本设备和器具基本设备和器具 用于细菌培养的温箱、用于细菌培养的温箱、C0C02 2培养箱、厌氧培养箱、厌氧培养设备；培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显用于观察细菌形态及标本直接镜检

29、的显微镜；微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的括接种环和接种针；制备培养基时用的pHpH计计 用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。皿，以及离心机、天平等。二、培二、培 养养 基基由人工方法配制而成的，专供

30、微生物生长繁殖由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、生化特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和生化特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。必不可少的手段。(一)培养基的组成成分1.1.营养物质营养物质:(1):(1)蛋白胨；蛋白胨；(2)(2)肉浸液；肉浸液；(3)(3)牛肉膏；牛肉膏；(4)(4)糖类；糖类；(5)(5)血液；血液；(6)(6)无机盐类；无机盐类；(7)(7)

31、鸡蛋和动物血鸡蛋和动物血清；清；(8)(8)生长因子：提供细菌生长繁殖所需要的氮源生长因子：提供细菌生长繁殖所需要的氮源和碳源，还有生长因子。和碳源，还有生长因子。2.2.凝固物质凝固物质 制备固体培养基时，加入琼脂，琼脂是半制备固体培养基时，加入琼脂，琼脂是半乳糖胶，乳糖胶，9898以上时可溶于水，在以上时可溶于水，在45 45 以下则凝固以下则凝固成凝胶状态。明胶、卵白蛋白、血清。成凝胶状态。明胶、卵白蛋白、血清。3.3.抑制剂和指示剂抑制剂和指示剂 用于选择、鉴定及判断结果。用于选择、鉴定及判断结果。(二二)培养基种类（按用途分类）培养基种类（按用途分类）1 1基础培养基基础培养基 含有

32、生长所需的基本营养成分，含有生长所需的基本营养成分，称肉汤，用于增菌、检验，是制备其他培养基称肉汤，用于增菌、检验，是制备其他培养基的基础成分。的基础成分。2 2营养培养基营养培养基 在基础培养基中可加入葡萄糖、在基础培养基中可加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长。最常的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长。最常用的是血平板等。用的是血平板等。3 3鉴别培养基鉴别培养基 利用细菌分解能力及代利用细菌分解能力及代 谢产物的不同，在培养基中加入特定谢产物的不同，在培养基中加入特定 的作用底物和指示剂，观察细菌生长

33、的作用底物和指示剂，观察细菌生长 过程中分解底物所释放的不同产物，过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。如糖发酵培养基。如糖发酵培养基。4 4选择培养基选择培养基 在培养基中加入抑制剂而在培养基中加入抑制剂而 抑制杂菌生长，有助于对所选择的细菌抑制杂菌生长，有助于对所选择的细菌 生长。生长。5 5特殊培养基包括厌氧培养基和细菌特殊培养基包括厌氧培养基和细菌L L型型 培养基等。培养基等。(二二)培养基种类（按物理性状分类）培养基种类（按物理性状分类）n1、液体培养基：主要用于增菌、液体培养基：主要用于增菌n2、半固体培养基：主要用于观察

34、细菌动力、半固体培养基：主要用于观察细菌动力、保存菌种等。保存菌种等。n3、固体培养基：主要用于细菌分离培养。、固体培养基：主要用于细菌分离培养。又分为平板、斜面、高层及高层斜面又分为平板、斜面、高层及高层斜面(二二)培养基种类（按组成成分分类）培养基种类（按组成成分分类）n1、合成培养基：、合成培养基：用各种营养物质组成的培养基，这种培养基用各种营养物质组成的培养基，这种培养基成分都是已知的。其特点是成分精确、重复性强，价格较贵。成分都是已知的。其特点是成分精确、重复性强，价格较贵。用于实验室内做有关细菌营养、代谢、分类、鉴定、生物学特用于实验室内做有关细菌营养、代谢、分类、鉴定、生物学特性

35、测定、选育菌种、遗传分析等研究工作。性测定、选育菌种、遗传分析等研究工作。n2、半合成培养基：、半合成培养基：成分部分已知，微生物实验室用的大部分成分部分已知，微生物实验室用的大部分为此类培养基。如蛋白胨、牛肉膏、为此类培养基。如蛋白胨、牛肉膏、SS琼脂等。琼脂等。n3、非合成培养基：、非合成培养基：如牛乳培养基、鸡蛋培养基、马铃薯培养如牛乳培养基、鸡蛋培养基、马铃薯培养基等，均属非合成性的培养基。基等，均属非合成性的培养基。(三)分离培养基的选择 依据卫生部临床检验中心推荐，应备有依据卫生部临床检验中心推荐，应备有 如下分离培养基：如下分离培养基：1 1血平板血平板 适于各类细菌的生长。适于

36、各类细菌的生长。2 2巧克力血平板巧克力血平板 其中含有其中含有V V和和X X因子，因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的 标本。标本。3 3中国蓝平板或伊红美蓝平板中国蓝平板或伊红美蓝平板 有选择地促进有选择地促进G G_ _菌生长，是较好的弱选择性培养基。菌生长，是较好的弱选择性培养基。4 4麦康凯平板麦康凯平板 具中等强度选择性，是非发酵具中等强度选择性，是非发酵菌鉴定的依据。菌鉴定的依据。5 5SSSS琼脂琼脂 有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。门菌的分离。6 6碱性琼脂碱性琼脂 用于从粪便中分离霍乱弧菌及其用于从

37、粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。它弧菌。7 7血液增菌培养基血液增菌培养基 用于从血液、骨髓中分离用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。常见病原菌。8 8营养肉汤营养肉汤 用于标本及各类细菌的增菌。用于标本及各类细菌的增菌。三、细菌接种与分离技术(一一)平板划线分离法平板划线分离法 1 1连续划线分离法连续划线分离法 此法主要用于此法主要用于 杂菌不多的标本。杂菌不多的标本。2 2分区划线分离法分区划线分离法 本法适用于杂本法适用于杂 菌量较多的标本。获得单个菌落。菌量较多的标本。获得单个菌落。(二二)斜面接种法斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观该法主要用于单个菌落的纯培养、保存

38、菌种或观察细菌的某些特性。察细菌的某些特性。(三三)液体接种法液体接种法 在试管内壁与液面交接处研磨，多用于一些液体在试管内壁与液面交接处研磨，多用于一些液体生化试验管的接种。生化试验管的接种。(四四)穿刺接种法穿刺接种法 此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。种。(五五)倾注平板法倾注平板法 测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。法。(六六)涂布接种法涂布接种法 常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。本中的细菌计数。四、细菌培养方法

39、 (一一)需氧培养法需氧培养法 最常用的培养方法，适于需氧和兼性最常用的培养方法，适于需氧和兼性厌氧菌的培养。厌氧菌的培养。(二二)二氧化碳培养法二氧化碳培养法 常以下列方法供给常以下列方法供给 C0C02 2。1 1二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱 是一台特制的培养是一台特制的培养箱，既能调节箱，既能调节C0C02 2的含量，又能调节所需的的含量，又能调节所需的温度。温度。此法适于大型实验室应用。此法适于大型实验室应用。2 2烛缸法烛缸法 将已接种好的培养基置干燥器内，并放人将已接种好的培养基置干燥器内，并放人点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂亡凡士林，盖点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂亡凡士林，盖上盖子

40、，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内器内C02C02含量约占含量约占5 5-10-10，然后将干燥器放，然后将干燥器放入入35 35 温箱内培养。温箱内培养。3 3化学法化学法 按每升容积加入碳酸氢钠按每升容积加入碳酸氢钠0 04g4g和浓盐和浓盐酸酸0 035ml35ml的比例，分别置于容器内。将容的比例，分别置于容器内。将容器连同接种好的培养基都放人干燥器内，器连同接种好的培养基都放人干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成碳酸氢钠接触生成COCO2 2。(三三)厌氧培养法：厌氧罐、厌氧手套

41、箱厌氧培养法：厌氧罐、厌氧手套箱第五节细菌产物的检测及鉴定第五节细菌产物的检测及鉴定 一、细菌毒素的检测一、细菌毒素的检测 (一一)内毒素的测定内毒素的测定 主要用于诊断病人是否发生革兰阴性主要用于诊断病人是否发生革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用液细菌感染。另外，还可用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。和生物制品有无内毒素污染。1 1细菌内毒素的致热作用细菌内毒素的致热作用 常以家兔常以家兔作为实验动物，家兔正常体温作为实验动物，家兔正常体温38385 5 40 40 。抽取被检物注入家兔耳。抽取被检物注入家兔耳静脉，记录体温变化情况，分析实验静脉，记录体温变化情况，分析实验结

42、果。结果。2 2鲎（鲎（houhou)试验试验 鲎血液的有核变形细胞内含鲎血液的有核变形细胞内含凝固酶原及凝固蛋白原，当内毒素与鲎变形细凝固酶原及凝固蛋白原，当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物胞冻融后的溶解物(鲎试剂鲎试剂)接触时，可激活凝接触时，可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原变成凝胶状态固酶原，使可溶性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白，利用此种反应来检测内毒素。的凝固蛋白，利用此种反应来检测内毒素。本试验对内毒素具有高度特异性，灵敏度高，本试验对内毒素具有高度特异性，灵敏度高，可检查出可检查出0 0005005 0 00005g0005gmlml内毒素。内毒素。且操作简便，速度快，在

43、且操作简便，速度快，在2h2h内即可得出结论。内即可得出结论。(二二)外毒素的测定外毒素的测定1 1体内毒力试验体内毒力试验 细菌外毒素对机体的毒细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。物不产生中毒症状。2 2体外毒力试验体外毒力试验 外毒素抗原性强，可刺外毒素抗原性强，可刺激机体产生相应的抗体。在体外以细菌外激机体产生相应的抗体。在体外以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素外毒素(抗原抗原)进行抗原抗体反

44、应，来检测进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。如白喉棒状杆菌的如白喉棒状杆菌的ElekElek平板毒力测定。平板毒力测定。ELISAELISA法如葡萄球菌肠毒素、肠产毒法如葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌型大肠埃希菌LTLT及及STST等的测定。等的测定。二、细菌生化反应鉴定二、细菌生化反应鉴定 不同细菌具有各自独特的酶系统，因不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物同

45、的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。菌。(一一)碳水化合物的代谢试验碳水化合物的代谢试验 1 1糖糖(醇、苷醇、苷)类发酵试验类发酵试验(1)(1)原理：由于细菌含有发酵不同糖类的酶，故原理：由于细菌含有发酵不同糖类的酶，故分解糖的能力不同，终末产物亦不一致。有分解糖的能力不同，终末产物亦不一致。有的能分解，有的仅能分解的能分解，有的仅能分解1-21-2种，还有的不能种，还有的不能分解。有的产酸产气，有的仅产酸，故可利分解。有的产酸产气，有的仅产酸，故可利用鉴别细菌。用鉴别细菌。(2)(2)培养基：在培养基中加入培养基：在培养

46、基中加入0.50.5-1-1的的糖类糖类(单糖、双糖或多糖单糖、双糖或多糖)、醇类、醇类(甘露醇、甘露醇、肌醇等肌醇等)、苷类、苷类(水杨苷、菊糖等水杨苷、菊糖等)。可为。可为液体、半固体、固体或微量生化管几种液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。类型。(3)(3)方法：将细菌接种到糖发酵培养基中，方法：将细菌接种到糖发酵培养基中，培养数培养数h h小时至小时至2w2w后，观察结果。后，观察结果。(4)(4)结果：能分解糖产酸时，呈酸性反应，结果：能分解糖产酸时，呈酸性反应，若产气可出现气泡或培养基内有裂隙等若产气可出现气泡或培养基内有裂隙等现象现象;若不分解，除有细菌生长外，无任若不分解，

47、除有细菌生长外，无任何变化。何变化。(5)(5)应用：是鉴定细菌最主要的试验，特应用：是鉴定细菌最主要的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要 。2 2氧化一发酵试验氧化一发酵试验(O(OF F试验试验)(1)(1)原理：细菌分解葡萄糖必须有分子氧参原理：细菌分解葡萄糖必须有分子氧参加的称为氧化型；进行无氧降解的称为发加的称为氧化型；进行无氧降解的称为发酵型；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。酵型；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。(2)(2)培养基培养基HLHL：Hugh-LeifsonHugh-Leifs

48、on二氏培养基。二氏培养基。(3)3)方法：将待检菌同时穿刺接种两支方法：将待检菌同时穿刺接种两支HLHL培养基，培养基，一支滴加无菌液体石蜡，高度不少于一支滴加无菌液体石蜡，高度不少于1cm1cm。将培。将培养基于养基于35 35 培养培养48h48h或更长或更长。(4)(4)结果：两支培养基均无变化为产碱型或小分结果：两支培养基均无变化为产碱型或小分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若不加解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若不加石蜡的培养基产酸为氧化型。石蜡的培养基产酸为氧化型。(5)(5)应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别型或产碱型。也呵用于

49、葡萄球菌与微球菌鉴别型或产碱型。也呵用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。间的鉴别。3-半乳糖苷酶试验半乳糖苷酶试验(1)(1)原理：有的细菌可产生原理：有的细菌可产生 半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，能分解邻能分解邻-硝基酚硝基酚 -D-D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)(ONPG)，而生成黄色的邻，而生成黄色的邻-硝基酚，在很硝基酚，在很低浓度下也可检出。低浓度下也可检出。(2)(2)试剂：试剂：O O75M ONPG75M ONPG溶液：取溶液：取80mg80mg溶于溶于15ml15ml蒸馏水中，在加入缓冲液蒸馏水中，在加入缓冲液(6(69g 9g NaHNaH 2 2POPO4 4溶于溶于45ml45m

50、l蒸馏水中，用蒸馏水中，用3030NaOHNaOH调控调控pHpH为为7.07.0，再加水至，再加水至50ml)5ml50ml)5ml，置，置44冰箱中保存。冰箱中保存。（3 3）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于于0.25ml0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，无菌生理盐水中制成菌悬液，加入甲苯并充分振摇，使酶释放。将试加入甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置管置37 37 水浴水浴5min5min，加入，加入0.25mlONPG0.25mlONPG试试剂，水浴剂，水浴20min320min3小时观察结果。小时观察结果。(4)(4)结果：菌悬液呈现黄色为阳性