图位克隆-李金伟课件.ppt
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1、图位克隆技术原理图位克隆技术原理李金伟李金伟20122154232012215423无论头上是怎样的天空,我准备承受任何风暴。内容简要内容简要图位克隆技术的基本原理1图位克隆的一般步骤(考研)2图位克隆在植物基因分离中的应用3图位克隆的现状和前景4图位克隆技术的基本原理图位克隆技术的基本原理v图位克隆(Map-basedcloning)又称定位克隆(positionalcloning),1986年首先由剑桥大学的Alancoulson提出,是近几年来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展起来的一种行的基因克隆的一种方法图位克隆技术的基本原理图位克隆技术的基本原理基本原理:功能基因在基因组中都
2、有相对较稳定的基因座,再利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上,用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库(包括YAC,BAC,TAC或Cosmid等),从而构建基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆,最后经过遗传转化试验证实目的基因功能。图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤图位克隆的主要步骤(复旦大学2003细胞生物学考研试题)图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤 2.12.22.4 筛选与目的基因紧密连锁的分子标记目的基因的定位目的基
3、因的筛选和鉴定 2.3构建高质量、容易操作的大片段基因组文库图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.1筛选与目的基因连锁的分子标记 筛选与目标基因连锁的分子标记(molecular markers)是实现基因图位克隆的关键。实质上,分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因,精确的分子标记能够极大地提高图位克隆的效率。迄今为止,已有几十种技术可用于分子标记的筛选,包括有:RFLP标记、RAPD标记、AFLP标记、SSLP标记、SSR标记、SNP标记等。其中最为常用的是简单序列长度多态性(SSLPs)和单核苷酸多态性(SNPs)图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤SSLPsSSLPs S
4、SLP是基于PCR的分子标记,检测比较直接,只需要通过设计引物便可检测鉴定的SSLP标记最为常用的最为常用的分子分子标记标记SNPsSNPs SNPs标记的检测也比较直接,它是不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别,这些差别的核苷酸通常位于不编码区域,常见的检测SNPs标记的方法主要是剪切扩增多态性序列(CAPS),它是基于PCR的图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤图位克隆的分子标记示意图图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.2目的基因的定位 目的基因的定位分为初定位和精细定位图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.2.1初定位 目的基因初定位是利用分子标记在一个目标性状的分离群体中把目
5、的基因定位于染色体的一定区域内。初定位通常使用近等基因系法或群组分离分析法。近等基因系是指只有目标性状基因有差异其他性状基因相同的2个群体,可以通过连续回交的途径获得。群组分离分析法,将分离群体中的研究的目标性状根据其类型分成2组,将每组内一定数量的植株DNA等量混合,形成2个池,这2个池仅在目标性状上有差异。利用分子标记技术寻找2个池的扩增谱带的差异,这种多态性极可能与目标基因连锁。用所有的分离后代单株,验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离的确定。如果分离群体不易获得,可采取混合样品法图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.2.2精细定位(最艰难、最耗时的限速步骤)在初步定位的基础上
6、,接下来就要利用高密度的分子标记连锁图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分析以便精细定位目的基因。精细定位通常采用的方法是侧翼分子标记或者混合样品作图。图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤指利用初步定位的目的基因两侧的分子标记,鉴定更大群体的单株来确定与目的基因紧密连锁的分子标记,Dixon等(1995)利用该方法已成功的将番茄的叶霉病基因Cf2精细定位到40kb的区间。侧翼分子标记需要对单个植株进行分析,工作效率低指在准确鉴定目的基因表型(单基因控制的隐性突变)的基础上,把大群体中单株突变体分成若干组,以组为单位提取DNA,形成一个混合的DNA池进行分析,根据所有池中分子标记与目的基因
7、发生的重组数来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记及目的基因附近所有分子标记的顺序图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤 一旦把目的基因定位在某染色体的特定区域后,接下来就要对其进行精细的作图。目前,作图的类型可分为2类,分别是遗传图谱和物理图谱。遗传图谱对图位克隆非常重要,尤其是精细的遗传图谱。增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的基础,可以通过整合已有的遗传图谱,或者是寻找新的分子标记来实现。图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.3构建高质量、容易操作的大片段基因组文库 在基因的图位克隆技术中,高质量的基因组文库的构建也是克隆成功的关键。图位克隆的基因组文库主要有Cos质粒文库和人工染色体
8、文库。Cos质粒是一种含有噬菌体的Cos位点的质粒载体,大小在57kb左右,可高效的地克隆2535kb的DNA片段。人工染色体的插入片段最长可达2Mb左右,能够覆盖完整的真核基因,最早发展的人工染色体是YAC。所以当要克隆大片段DNA时,需要YAC作载体。以YAC为载体,可将3001000kb的DNA片段克隆。因此以YAC为载体可以构建高等植物的完整基因组文库。图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤2.4目的基因的筛选和鉴定2.4.1目的基因的筛选 筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个关键环节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后,就可以利用该克隆为探针
9、进行染色体步移,逐渐靠近目的基因。图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤 染色体步移是指利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆,如此得到的阳性克隆是“一步克隆”,再利用新获得的探针对文库进行第二次杂交,得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”,如此反复即可取到所需的克隆,获得目的基因。染色体步移的主要局限在于当必须经过一个无法克隆的片段时,步移的过程会被打断;当克隆的一端是重复序列时,步移的方向会发生偏差。为克服这些弊端,Tanksley等(1995)又发展了染色体登陆的方法。图位克隆的一般步骤图位克隆的一般步骤 染色体登陆是找出与目的基因的物理距离小于基因组文库插
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