仪器分析色谱法课件.ppt

1、色谱分析法Chromatography2标题添加点击此处输入相关文本内容点击此处输入相关文本内容前言点击此处输入相关文本内容标题添加点击此处输入相关文本内容第一章 色谱法引论一、概述问题1 1：什么是色谱法？问题2 2：为什么色谱法能将混合物分开？问题3 3：色谱法的分类？问题4 4：各种色谱法的应用范围？1、什么是色谱法？茨维特的实验茨维特：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作，在1906 年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。茨维特的实验碳酸钙石油醚什么是色谱法？vChromatographyChromatographyv色谱法是一种分离方法。特点：有两相，一是固定相（stationa

2、ry stationary phasephase），一是流动相（mobile phasemobile phase），两相作相向运动。v将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。因此色谱分析是一种分离、分析法。2、色谱法分离原理v当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。83.色谱分析仪器的基本流程v流动相携带进样装置引入的混合试样进入色谱柱v混合试样在色谱柱中进行分离v各组分依次进入检测器检测v检测响应

3、信号导入计算机v得到色谱图流动相输送系统进样装置色谱柱检测器数据记录与处理min05101520253035mAU020406080100 DAD1 C,Sig=270,16 Ref=360,100(HUPINGDSLS-A21.D)例如：气相色谱仪（动画）4、色谱法的分类按流动相状态的不同，可分为以下三类：气相色谱法 (Gas Chromatography,GC)液相色谱法 (Liquid Chromatography，LC)超临界流体色谱 (Supercritical Fluid Chromatography，SFC)什么是气相色谱法？v 以气体为流动相的色谱法v Gas Chromato

4、gaphy，简称GCv按固定相状态的不同可分为：气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)11v应用范围：用于分离分析易汽化（在-190-500范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。1213什么是液相色谱法？v 以液体为流动相的色谱法v Liquid Chromatography，简称LCv 应用范围：用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。14其他分类方式按固定相使用的形式可分为v柱色谱（column chromatographycolumn chromatography）将固定相装在色谱柱内v纸色谱（Paper Chro

5、matographyPaper Chromatography）用滤纸做固定相或固定相载体的色谱v薄层色谱（Thin Lay Thin Lay ChromatographyChromatography）固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上16应用举例 TLC 1 2 3 4 5 6 7 8 9Bands Description 1 Pseudoginsenoside F11 2 American Ginseng 3 Ginsenoside Rg1 4 Ginsenoside Rf 5 Ginseng 6 Ginsenoside Rc 7 Ginsenoside Rb1 8 Notoginseng 9

6、Notoginsenoside R1Identification of Ginseng,America ginseng and Notoginseng二、色谱法基本理论v拟解决的问题色谱相关术语色谱法理论的概况色谱中的动力学理论色谱分离情况的评价方法影响色谱分离的主要因素及条件选择（从理论的角度加以判断）1、色谱相关术语v关于色谱峰v关于保留值v关于分配平衡 0ootMtRtRA2 CIJABEGFHDW Wh/2 关于色谱峰的术语峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差色谱流出曲线v峰底宽、半峰宽及标准偏差三者的关系为：Y=4，Y1/2=2.354v拖尾峰v伸舌峰v鬼峰、假峰v畸峰v基线漂移v基线

7、噪声v谱带扩张 关于保留值的术语v死时间（t0，tM）：无保留组分出峰时间v保留时间（tR）：v调整保留时间（tR）：0tttRRv死体积（V V0 0，V VM M）：v保留体积（V VR R）：v调整保留体积（V VR R）：FctV00FctVRRFcttFctVRRR)(0v相对保留值（r ri,si,s）：相对保留值又称为选择性因子（）在气相色谱中，相对保留值的大小仅与固定相种类和柱温有关。在液相色谱中，相对保留值的大小不仅与固定相种类和柱温有关，还与流动相种类及配比有关。,RsRiRsRisiVVttr24 关于分配平衡的术语v分配系数K（distribution coeffici

8、ent）smKcc每毫升固定相上溶解（或吸附）溶质的量每毫升流动相上溶质的量v 分配比k 又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。0ttVVKkRMSsmmkmtR：组分在固定相中停留的时间，和组分在固定相中的质量ms成正比t0：组分在流动相中停留的时间，和组分在流动相中的质量mm成正比v相比：色谱柱内固定相和流动相体积之比是柱型及结构的重要特征。kKVVSM282、色谱分析法动力学理论v研究理论的目的解决色谱峰的分离问题v三个色谱基本理论问题色谱热力学问题发展高选择性色谱柱色谱动力学问题

9、发展高效能色谱柱分离条件的最优化问题分离条件优化29v色谱动力学理论研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素 塔板理论 速率理论30（1）塔板理论 塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程(推导自学）31vt t=t tR R时，C C=C Cmaxmax，峰高正比于浓度C C0 0，是峰高定量的基础。v当n n越大，柱效越大，C Cmaxmax/C C0 0越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。vC Cmaxmax反比于t tR R，t tR R小，C Cmaxmax大，保留时间小的组分峰高且窄。t tR R大，C Cmaxmax小，保留时间大的组分峰低且宽。对色

10、谱流出曲线方程的讨论22()022RttRCCetn32 柱效n(n(塔板数）的定义 由流出曲线方程导出：v H=L/nH=L/n n n是峰相对展宽的量度 n n是柱效的量度 n n是常数时，Y Y与t tR R 成正比 n n越大，h h越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。222/122/1)(16)(54.5)(2ln8YtYtYtnRRR33 塔板理论的贡献v塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。v导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。v导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。34 塔板理论的局限v

11、塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。v不能解释流速对理论塔板数的影响。v有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。35（2 2）速率理论v速率理论是1956年荷兰学者Van Deemter等提出，因此又称作范第姆特方程v运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素 36v根据塔板计算公式：n=5.54(tR/Y1/2)2v速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，也就是影响塔板高度H的因素。vH=A+B/u+Cu37

12、涡流扩散项A=2dp涡流扩散项均匀性因子粒径38v涡流扩散项A A：由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。39 分子扩散项vB/uvB=2Dg弯曲因子扩散系数 Z (ttt)13 240v分子扩散项：由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵

13、向扩散，引起色谱峰扩展。41 传质阻力项由气相传质阻力和液相传质阻力两项构成 平衡浓度固定相传质阻力引起非平衡过程示意图实际浓度分界面流动相42i)i)气相传质阻力项v气相传质阻力项：试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。43气相传质阻力项表达式vCguvCg=容量因子44ii)ii)液相传质阻力项v液相传质阻力项：试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定相表

14、面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。45液相传质阻力相表达式vCL uvCL=液膜厚度液相扩散系数46 气相色谱中的速率方程uDdkkDgdkkuDgdpHLfp22222)1(32)1(01.02247 速率方程给我们的什么启示v为柱型的研究和发展提供理论依据v为操作条件的选择提供理论指导v为色谱柱的填充提供理论指导48i)对柱型研究和发展的影响vA A=0?=0?vGolay1957Golay1957年提出毛细管柱的概念（opentubeopentube）v毛细管柱A A=0=0，H H=B B/u+/u+C Cu uvH H，N N，分离能力大大提高49对柱型研究和发展的影响vB=0?v溶

15、质在液体中的扩散系数DL10-5cm2/sv溶质在气体中的扩散系数Dg10-1cm2/svDL Dgv当采用液体作流动相时 B0v液体作流动相时可用更细的固定相，A vHPLC柱效比GC要高23个数量级50ii)操作条件对柱效的影响 u/cm.s-1 51载气线速度（流速）的影响v最佳流速：u=(B/C)1/2v实用最佳流速：比最佳流速更快vA与流速无关vB/u：当流速小时，对H的大小起主导作用vCu：当流速大时，对H的大小起主导作用52容量因子k的影响v不同组分k不同，测出的柱效不同v在气相传质阻力相中，k，Cg 理论上说k越小柱效越高，实际不可取v在液相传质阻力相中，k ，Cl先，后当k=

16、1时，最大。v希望k在一个合适的范围内，通过改变柱温，固定相，柱型参数等可实现。53柱温的影响v间接影响、十分复杂v对k k影响，对扩散系数影响，从而对柱效产生影响，但影响情况难以判断54iii)对色谱柱的填充提供理论指导v固定相粒径dp：根据速率方程，粒径减小，A项减小，C项减小，柱效增加。但粒径太小，不易填充，同时A项增大。v柱长L：柱长增加，总塔板数增加，但柱长增加，分离时间将增加。v柱径：柱径越小，柱效越高，但柱径越小，固定相越难填充均匀。55v液膜厚度df：从柱效角度考虑，液膜越薄，柱效越高（根据速率方程），但允许的进样量减小。固定液与担体的配比一般在5:100-25:100之间，但

17、现在更低配比的固定相也应用广泛。更重要的是：不同沸点的物质，应采用不同配比的固定相。563.色谱分离基本方程对于常规分析工作，一般选用：v选择性系数（相对保留值）与保留指数I来评价固定液v有效塔板数N有效来评价色谱柱与分离条件v以分离度R R 作为柱的总分离效能指标57（1）几个概念选择性系数v定义与相对保留值(ri,s)基本相同v不同之处在于:选择性系数是两个相邻峰的 调 整 保 留 值 之 比（后 峰 比 前 峰，1），而不是被测物与标准物质的调整保留值之比（可小于1）v它是评价固定液选择性的指标。选择性系数越大，该柱对此相邻峰的分离越好。58几个概念有效塔板数N有效v在气相色谱中，通常用

18、有效塔板数N N有效和有效塔板高度H有效来评价柱子的分离效能，它扣除了死体积对分离的影响，更好地反映了柱子的实际分离效能。v柱效越高，该柱的分离能力越好。22/122/154.554.5YtYttRMRN有效59几个概念分离度R)(2121)1()2(YYttRRR)(21)2(2/1)1(2/1)1()2(2/1YYttRRR60(2)色谱分离基本方程（Purnell方程）kttkmmmRuuttuLtuLtMRMSMSSRMMSR111，n 公式推导61)1)(1(41/114114141161)2()2()1()2()1()2(21212kknRtttttknRttktnRRkkkYYY

19、tnYYtnkttRMRRRRRMRRMR理论的定义中带入，设62（3）色谱分离基本方程的启示要改善物质对的分离（提高R R），即提高两相邻物质的分离度，可以采取以下措施：提高柱效N N提高选择性系数增大容量因子k kkknR11463N的影响，如何提高N？v分离度R与理论塔板数N的平方根成正比关系，增加塔板数，有利于提高分离度。v增加柱长可增加N，改善分离，但分析时间将大大延长，峰产生扩展。v减小塔板高度H：根据速率方程的启示制备一根性能优良的色谱柱是十分重要的。根据速率方程选择合适的色谱条件同样有效。64K的影响，如何改变k？v分离度与容量因子有关，容量因子大，分离好 k 1 3 5 7

20、9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00v但当容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，k k的最佳范围是1k300 300 低于bp100-200 1-3%bp100-200 1-3%200-300 200-300 低于bp100 5-10%bp100 5-10%100-200 100-200 平均bpbp的2/3 10-15%2/3 10-15%气体 室温 15-25%15-25%吸附剂沸程范围100 100 程序升温具体的189汽化温度v一般进样方法下，汽化温度比柱温高30-70。v进样量大时

21、高一些好，保证瞬间汽化。v不可超过试样的分解温度。v其它气化温度与具体进样方式有关。190检测器相关参数v检测器温度：一般大于或等于柱温，具体与检测器种类有关。v热导桥电流：与载气种类有关v 氢火焰检测器的氮、氢、空流量及比例v 191进样量v液体试样一般进样量0.1-5l0.1-5l。v气体试样一般进样量为0.1-10ml0.1-10ml。v具体视柱类型，固定液含量（不能超过柱容量）、进样方式、检测器的灵敏度和线性范围等确定。192沸点340ppm级 MSFID塑化剂的测定193194第三章 高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography HPLC

22、195一、高效液相色谱法概述 GCGCHPLCHPLC应用范围热稳定、低沸点的物质热不稳定、高沸点、离子型的物质热力学理论较成熟正在发展中分析成本低高分离能力与柱的类型有关较高1.1.高效液相色谱法与气相色谱法的比较 1962.2.高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 经典液相色谱法高效液相色谱法粒径(m)(m)75-60075-6003-503-50（常用5-105-10）柱前压力(atm)(atm)0.01-1.00.01-1.020-30020-300分析时间 (h)(h)1-201-200.05-1.00.05-1.0色谱柱长度(cm)(cm)50-20050-2002-302-30柱

23、效(块/m)/m)2-502-5010104-10-105样品用量(g)(g)1-101-101010-6-10-10-21973.3.高效液相色谱法的特点v高压v高速v高效v高灵敏度1984.4.应用举例丹参Radix Salviae Miltiorrhizae199min102030405060mAU020406080100 DAD1 A,Sig=280,16 Ref=550,100(HUPINGDSFP-D47.D)丹参的HPLCHPLC指纹图谱200二、高效液相色谱理论基础vH=A+B/u+CuvA=2dpvB0vC=?201 迁移的流动相的传质阻力202 滞留的流动相的传质阻力203

24、高效液相色谱中的速率方程涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质uDdCDdCDdCuDCdHsfsmpsmpmmdp)(22222042052.对速率方程的讨论v选用细颗粒填料可获高柱效v流动相流速低，有利于达到高柱效v选用黏度小的流动相有利于提高柱效v温度的影响v液膜厚度的影响2063.柱外效应v由于色谱柱之外的因素引起的色谱峰的展宽，例如进样系统、连接管路及检测器的死体积等。207三、高效液相色谱仪1.高效液相色谱仪流程208高效液相色谱仪2092 2.高压输液系统 往复泵原理示意图 溶剂瓶123234210n 梯度洗提v梯度洗提 即程序控制流动相的组成，使在整个分离过

25、程中，溶剂强度按照特定的变化规律增加。优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。211溶剂A A溶剂B B电磁阀A A电磁阀B B混合室泵溶剂A A溶剂B B高压泵A A 高压泵B B混合室低压溶剂梯度方框图高压溶剂梯度方框图n 梯度洗提流程212应用举例2133.进样系统 六通进样阀结构示意图2144 4.分离系统色谱柱 包括柱管与固定相两部分一般色谱柱长530cm，内径为45mm凝胶色谱柱内径312mm微柱内径1-2mm，长1-5cm制备往内径较大，可达25mm 以上2155检测系统 n紫外检

26、测器n示差折光检测器n荧光检测器n电导检测器216（1 1）紫外检测器v固定波长的紫外检测器v可变波长的紫外检测器v二极管阵列检测器217固定波长的紫外检测器218 可变波长的紫外检测器219 二极管阵列检测器220二极管阵列检测器之三维图221二极管阵列检测器之Isoabsorbance Plot 222响应特性v选择性检测器，如芳烃类化合物的检测v灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质v线性范围宽，104-105v对温度及流动相的改变不敏感v适合梯度洗提vHPLC常规检测器223应用举例波长的选择224 （2 2）示差折光检测器225响应特性v通用性检测器v低灵敏度v基线易受温度的影响v不

27、适合梯度洗提226(3)(3)荧光检测器227响应特性v选择性检测器。如PAH，蛋白质v高灵敏度，比紫外高约1000倍v适合梯度洗提228应用举例229(4)(4)电导检测器检测器池体 2.电极 3.电源 4.电阻 5.相敏检波器 6.记录系统230响应特性v选择性检测器，对离子型化合物有响应v灵敏度高v受温度的影响v不能梯度洗提231（5）几种检测器特性比较 示差折光紫外荧光电导应用范围通用选择性高选择性选择性可否梯度淋洗不可可可不可线性范围10104 410105 510103 310104 4最小检测量ggngngpgpgngng对温度敏感度敏感低低敏感溶剂使用情况无限制受限制受限制受限

28、制232讨论：液相色谱检测器的选择葡萄糖产品的含量测定地下水中酚类化合物的分析矿泉水中无机阴离子的测定痕量氨基酸的分析去痛片中有效成分的分析链烷基磺酸盐的测定蛋白质的分子量测定233四、HPLC主要类型及其选择 v化学键合相色谱法 v液固色谱法 v离子对色谱法 v离子色谱法 v体积排阻色谱法 2341.1.化学键合相色谱法（1）分离机理v正相键合相色谱法：固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性或强极性化合物。分配机理：分配系数 x为溶质，M为溶剂 v反相键合相色谱法：固定相的极性小于流动相的极性，适于分离非极性、极性和离子性化合物。应用最广泛22MxxNHRSiOKp23

29、5反相键合相色谱法的疏溶剂机理：溶质进入极性流动相后，排挤部分溶质分子，其疏水基团由于流动相的斥力推动而直接与非极性固定相上的烷基缔合，构成单分子吸附层，这种作用时可逆的。当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥力下降。236（2 2）固定相 疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C C1818）和苯基极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇SiOOHSiOOHSiOOH固定相表面C H SiCl18 373SiOOSiOOSiOO固定相表面C H18 37Si237常用固定相238应用举例239（3 3）流动相v表征溶剂特性的重要参数溶剂强度：溶剂分子与吸附剂的亲合程度，越大，亲合力约大。溶解度参数：衡量溶剂

30、极性强度的指标，越大，极性越强。极性参数P P：溶剂与乙醇、二氧六环、硝基甲烷相互作用的度量，比较全面的反映了溶剂的性质。粘度：240溶剂EPxexdxn正己烷1.880.300.017.30.1四氢呋喃7.60.460.579.14.00.380.200.42乙腈37.50.340.6511.85.80.310.270.42甲醇32.70.540.9512.95.10.480.220.31水78.50.892110.20.370.370.25241n 溶剂的选择原则v溶剂具有稳定的化学性质v溶剂的选择与使用的检测器要有相容性v溶剂的粘度要小v溶剂的沸点不能太低v溶剂的纯度要高且价格便宜 24

31、2v正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷为主体，加入质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚，质子给予体氯仿，偶极溶剂二氯甲烷 v反相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇及其混合物等，以水为主体，加入质子接受体甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。243应用举例2442.2.液固色谱法（1）分离机理 以固体吸附剂为固定相的液相色谱法。由于溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附活性中心上进行竞争吸附，这种竞争吸附形成不同溶质在吸附剂表面的吸附、解吸平衡。平衡常数的不同导致不同溶质得以分离。245（2）固定相 极性固定相：硅胶、氧化镁、氧化铝等 非极性固定相：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等

32、246（3）流动相越大，洗脱力越强。合适的洗脱强度可通过混合溶剂来得到硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体，加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱强度。可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂247（4 4）应用v中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等v不同极性取代基的化合物v结构异构体和几何异构体混合物的分离248应用举例2493.3.离子对色谱法（1）分离机理将一种或数种与样品离子电荷（A+）相反的离子(B-)（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱 250,)(WA

33、BWABWOWWOABOWWBEkBEABAKBABAEBABA，分配系数萃取系数251（2 2）固定相、流动相和离子对试剂v固定相：多为C18,C8反相键合相v流动相：以水为主的缓冲液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶剂v离子对试剂：四丁基铵正离子、十六烷基三甲基铵正离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等252 （3 3）应用有机酸、有机碱特别是强酸强碱的分析，如羧酸、磺酸、胺类、酚类、药物、染料等2534.4.离子色谱法(1)(1)分离机理v试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应：阳离子交换：树脂SOSO3-3-H H+M+M+=树脂SOSO3-3-M M+H+H+阴离子交换：树脂NRNR3+

34、3+ClCl-+X+X-=树脂NRNR3+3+X X-+Cl+Cl-v不同的离子与树脂离子的交换能力（亲和能力）不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。254（2）固定相 离子交换剂，最常用的是乳胶薄壳型离子交换树脂小球，根据功能基可分为：强酸型（磺酸基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型（羧酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺）255（3）流动相 双柱抑制型：分离阳离子，一般采用无机酸如HCl，HNO3等；分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3、苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等256v离子交换色谱与离子色谱的分离原理一样v离子色谱最大的改进是解决了微量组分的检测问题 双柱抑制型：在分离柱

35、和检测器之间加一个化学抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二是增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。单柱非抑制型：淋洗液直接进入电导检测器。简单、分辨率较好。（4 4）离子色谱仪的结构257258电化学自再生微膜抑制器结构示意图（阴离子）259 （5）应用v分析无机阴离子的首选方法v还可用于分析无机阳离子，有机酸、碱，糖类、蛋白质等。260应用举例 7种阴离子的色谱图1.F-，2.Cl-，3.NO2-，4.Br-，5.NO3-，6.PO43-，7.SO42-2615.5.体积排阻色谱法（SECSEC）(1)分离原理以多孔凝胶为固定相，利用精确控制的凝胶孔径，使样品中不同分子大小

36、的组分得以分离。V VR R=V=V0 0+K+KD DVp Vp 0K 0KD D1.01.0洗脱体积在V V0 0 和V V0 0+Vp+Vp之间，峰容量有限，10-1210-12个峰用于分离分子大小差大于10%10%的样品262263v使用水溶液的凝胶过滤色谱法（GFC），主要用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。v使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法(GPC)，主要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的测定264（2）固定相v软质凝胶：如交联葡聚糖等，水相分离生化体系，适于低、中压操作v半刚性凝胶：较高交联度的苯乙烯、二乙烯苯共聚物，有机相洗脱，可承受10Mpa10Mpa的压力v硬质凝胶高交

37、联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝胶渗透色谱法多孔球形硅胶：凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法羟基化聚醚多孔微球：凝胶过滤色谱法265（3）流动相v改善分离主要通过固定相来实现。流动相的选择原则是：溶解样品、与凝胶浸润、与检测器匹配、粘度小。如四氢呋喃；缓冲溶液266（4）应用v大分子的分离分析v聚合物分子量分布的测定267应用举例1.聚乙二醇40000 2.聚乙二醇100003.聚乙二醇3000 4.聚乙二醇1000 5.聚乙二醇2686.6.液相色谱分离类型及条件选择v选择合适的液相色谱分离类型 了解分析对象 要分析的组分的大致浓度 干扰物质 试样的性质结构分子量酸碱性溶解性269 溶于水排阻色谱

38、，水为流动相 相对分子质量 2000 不溶于水排阻色谱，非水流动相 同系物键合相色谱 不溶于水 异构体液固色谱样品 分子大小差异排阻色谱 反相键合相色谱 相对分子质量 溶于水，不离解 2000 排阻色谱，水为流动相 碱阳离子色谱 溶于水，可离解 酸阴离子色谱 溶于水，离子与非离子反相离子对色谱 270v选择合适的分析条件色谱柱流动相检测器的种类及条件（波长等）样品的预处理方法271标准银杏提取物中银杏内酯的含量测定6%6%的内酯，24%24%的黄酮不汽化紫外末端吸收复杂、基体干扰较多举例272v醇溶性、中性：反相键合相色谱法v无紫外吸收：RI、ELSD、MSv含量低：ELSD、MSv干扰大：净

39、化，SPE、SFE273反相键合相色谱法色谱柱：C18C18柱流动相：H H2 2O OMeOHMeOH THF(70:20:10)THF(70:20:10)检测器：RI detectorRI detector内标法定量274色谱分析方法及条件选择v 了解分析对象v 明确分析要求v 查找相关文献v 确定分析方法v 选择样品前处理方法v 优化分析条件v 方法学验证v 样品测试275奶制品中三聚氰胺的检测方法2761.高效液相色谱分析方法离子对色谱法样品预处理1)1)沉淀离心去蛋白2)2)固相萃取：阳离子交换固相萃取柱277未经样品前处理的奶粉样品经预处理后的奶粉样品278v色谱柱：Polaris

40、 C18-A（4.6X250mmX5m）v缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠v流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15v进样量：10uLv流速：1.0mL/minv柱温：40v波长：240nm2792.液相色谱-质谱联用vLC 参考条件a)色谱柱：强阳离子交换与反相C18混合填料，混合比例（1：4），150 mm2.0 mm（i.d.），5 m，或相当者。b)流动相：等体积的乙酸铵溶液和乙腈充分混合，用乙酸调节至pH=3.0后备用。c)进样量：10 L。d)柱温：40。e)流速：0.2 mL/min。280基质匹配加标三聚氰胺的样品LC-MS/MS 多反应监测质量色谱图2813.气相色谱-质谱联用分析v样品的衍生化vBSTFA Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide 双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺等v毛细管气相色谱柱v选择离子监测282Q&A问答环节敏而好学，不耻下问。学问学问，边学边问。Heisquickandeagertolearn.Learningislearningandasking.283结束语感谢参与本课程，也感激大家对我们工作的支持与积极的参与。课程后会发放课程满意度评估表，如果对我们课程或者工作有什么建议和意见，也请写在上边点击进入284感谢您的观看与聆听本课件下载后可根据实际情况进行调整