霍奇金淋巴瘤实验设计PPT课件.pptx

1、研究背景霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤（Hodgkins lymphoma，HL，Hodgkins disease，）是，）是恶性淋巴恶性淋巴瘤瘤的一个独特类型。的一个独特类型。研究背景 其特点为：临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。原发于结外淋巴组织的少见。研究背景 瘤组织成分多样，但HL特异性的病理改变为大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于1%Reed-Sternberg细胞（R-S细胞）。这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞)研究背景 p53和bcl-2基因突变 EB病毒感染 但证据均不足，HL的发病机制尚未明确肿瘤细胞研究背景 有研究发现NF-B(R

2、elA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。1 IB作为重要的NF-B通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。研究背景 将对IB激酶（IB kinase,IKK）无反应的IB突变体导入HRS细胞中可阻断NF-B的活化，导致细胞凋亡，说明IB在HL发病机制中有重要作用。2研究背景 Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IB mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IB蛋白结构改变导致。3研究目的 本实验意在：了解IB基因在HL中突变的情况；分析经典型HL HRS中IB突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；以及这些异常的病理意义，即其

3、与HL发病的相关性。实验材料与试剂 霍奇金淋巴瘤组织样本 CD30单抗（Dako公司，克隆号BerH2，效价1：20）Leica ASLMD激光显微系统 PCR引物（北京赛百胜公司）PCR仪（包括反应体系）DNA测序仪实验流程1.CD30免疫组化2.激光显微切割和DNA 提取3.IB基因扩增4.PCR产物检测5.待测基因外含子测序CD30免疫组化采用EnVision两步法。将冰冻组织切成6m厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含005 NP40的丙酮(vv)固定10 min，室温下自然干燥；CD30免疫组化 6 H2O2-甲醇，37 10 min，消除内源性过氧化物酶；加1：20

4、稀释的一抗；加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。激光显微切割和DNA 提取 用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本36组，每组约2570个细胞。切割周围的正常淋巴细胞每例2管，每管约50个细胞。扩增目的基因，上游引物：5-CACACTGTGCCCATCTACG-3，下游引物：5一GGTc1-ITIGCGGATGTCCAC一3。（缓冲体系：10X反应缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l，dNTP(10

5、mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l，模板20 l，总体积25 l。反应条件：94预变性5 min，94变性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4结束。以双蒸水代替DNA模板作为阴性对照。）IB基因扩增 对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IB 6个外显子进行半巢式PCR扩增。用已知IB外显子PCR扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞)IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化对HRS细胞、背

6、景中反应性增生细胞的IB 6个外显子进行半巢式PCR扩增。J Clin Invest,1997,100(12):2961-9.将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本36组，每组约2570个细胞。6 H2O2-甲醇，37 10 min，消除内源性过氧化物酶；Oncogene,1999,18(16):2567-77.Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Stern

7、berg cells J.取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）切割周围的正常淋巴细胞每例2管，PCR仪（包括反应体系）用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。反应条件：预变性95，5min，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。有研究发现NF-B(RelA/P50)的组成性激活是

8、霍奇金淋巴瘤细胞的特点。加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。反应条件：94预变性5 min，94变性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4结束。每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。在这种技术中，首先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式PCR。激光显微切割和DNA 提取PCR扩增反应体系扩增扩增IB第一和第二外显子反应体系：第一和第二外显子反应体系：10 X PCR缓冲液50 1，MgC1：

9、(25mmoiL)50 Ixl，dNTPs(10 mmol L)20 l，DMSO20 l，Taq DNA聚合酶(5 UpJ)10 l，DNA模板(05 gIL1)20 l，扩增第一外显子时加引物1 Ixl；扩增第二外显子时加引物03 l，补所需ddH2O使反应体系达到50 I。反应条件：预变性95，5min，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。扩增第一外显子时另加2 l DMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。反应条件同第一轮。扩增扩增IB第三到第六外显子反应体系

10、第三到第六外显子反应体系：第一轮，l0PCR缓冲液50 Ixl，MgCL2(25 mmolL)40 l，dNTPs(10 mmolL)20 l，Taq DNA聚合酶(5 U L)10 l，DNA模板(05 g L)20 l，引物1 l。反应条件同扩增一、二外显子者，但退火温度为63。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为125 L。反应条件为预变性95，5 min，继而95变性50 S，65退火30 S，72 oC延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。）PCR产物检测 取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。紫外灯下观察。IB的6个外显子阳

11、性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和 exon6(441bp)。预期结果电泳电泳条带不在同一水平线上基因明显突变。预期结果电泳电泳条带在同一水平线上。没有突变 点突变或分子量很小的碱基序列突变待测基因外含子测序 每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。预期结果测序碱基序列出现改变图A-箭头处为T-A突变（TGA为终止密码）图B-反向测序证实（蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）预期结果碱基序列没有突变 C、D分别为没有突

12、变的正、反向测序预期结果 肿瘤细胞IB基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IB基因没有突变。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB基因都没有突变。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB的突变率都增加IB基因参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有关IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化估计不会发生这种情况，如若发生则需要进一步研究参考文献1 Bargou R.C,et al.Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tum

13、or cells J.J Clin Invest,1997,100(12):2961-9.2 Dejardin E,et al.Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.Oncogene,1999,18(16):2567-77.3 Emmerich F,et al.Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kap

14、paB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.Blood,1999,94(9):3129-34.Thank you！J Clin Invest,1997,100(12):2961-9.肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB的突变率都增加Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化采用EnVision两步法。激光显微切割和DNA 提取每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA

15、测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。电泳条带在同一水平线上。EnVision两步法IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化C、D分别为没有突变的正、反向测序Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.1 Bargou R.Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB

16、 alpha gene in Reed-Sternberg cells J.第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。电泳条带在同一水平线上。激光显微切割和DNA 提取这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞)点突变或分子量很小的碱基序列突变巢式PCR 巢式聚合酶链反应巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction,nPCR)也称套式也称套式PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式PCR。为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，半巢式，设计单

17、条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，。反向测序 一个是正向引物（上游引物），正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5到3 另外一个就是反向引物（下游引物反向引物（下游引物），用它来测序就是反向测序（从下游往上测序），也就是3到5 如果片段在800以内，那么随便进行一个方向就能测出你全部的序列了 如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）EnVision两步法DAKO EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信

18、号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。CD30免疫组化采用EnVision两步法。将冰冻组织切成6m厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含005 NP40的丙酮(vv)固定10 min，室温下自然干燥；CD30免疫组化 6 H2O2-甲醇，37 10 min，消除内源性过氧化物酶；加1：20稀释的一抗；加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。预期结果电泳电泳条带在同一水平线上。没有突变 点突变或分子量很小的碱基序列突变参考文献1 Bargou R.C,et al.Constituti

19、ve nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.J Clin Invest,1997,100(12):2961-9.2 Dejardin E,et al.Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.Oncogene,1999,18(16):2567-77.3 Emmerich F,

20、et al.Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.Blood,1999,94(9):3129-34.Thank you！Oncogene,1999,18(16):2567-77.PCR仪（包括反应体系）1 Bargou R.扩增第一外显子时另加2 l DMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。点突变或分子量很小的碱基序列突变3 Emmerich F,e

21、t al.扩增IB第一和第二外显子反应体系：第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。切割周围的正常淋巴细胞每例2管，PCR仪（包括反应体系）（缓冲体系：10X反应缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l，对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IB 6个外显子进行半巢式PCR扩增。（缓冲体系：10X反应缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL

22、 L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l，IB的6个外显子阳性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、exon2(433bp)、exon3(399bp)、exon4(184bp)、exon5(381bp)和 exon6(441bp)。取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。反应条件为预变性95，5 min，继而95变性50 S，65退火30 S，72 oC延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。反应条件：预变性95，5m

23、in，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。C、D分别为没有突变的正、反向测序C、D分别为没有突变的正、反向测序点突变或分子量很小的碱基序列突变分析经典型HL HRS中IB突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IB 6个外显子进行半巢式PCR扩增。如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）DAKO EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-

24、50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。PCR仪（包括反应体系）取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.一个是正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5到3点突变或分子量很小的碱基序列突变第一轮，l0PCR缓冲液50 Ixl，MgCL2(2

25、5 mmolL)40 l，dNTPs(10 mmolL)20 l，Taq DNA聚合酶(5 U L)10 l，DNA模板(05 g L)20 l，引物1 l。有研究发现NF-B(RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。采用EnVision两步法。EnVision两步法EnVision两步法CD30单抗（Dako公司，克隆号BerH2，效价1：20）反应条件：预变性95，5min，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为125 L。PCR仪（包括反应体系）反应条件：预变性95，5min

26、，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。加1：20稀释的一抗；采用EnVision两步法。切割周围的正常淋巴细胞每例2管，用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp

27、以内是可信的）肿瘤细胞IB基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IB基因没有突变。3 Emmerich F,et al.（缓冲体系：10X反应缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l，第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。EnVision两步法采用EnVision两步法。Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocar

28、cinoma cells J.Leica ASLMD激光显微系统将冰冻组织切成6m厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含005 NP40的丙酮(vv)固定10 min，室温下自然干燥；Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IB mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IB蛋白结构改变导致。（蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞(镜影细胞)巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction,nPCR)也称套式PCR。反应条件：94预变性5 min，94变性1

29、min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4结束。反应条件：94预变性5 min，94变性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4结束。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB的突变率都增加每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。切割周围的正常淋巴细胞每例2管，点突变或分子量很小的碱基序列突变电泳条带不在同一水平线上基因明显突变。Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is requi

30、red for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有研究发现NF-B(RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化Leica ASLMD激光显微系统Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for prolife

31、ration and survival of Hodgkins disease tumor cells J.第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。肿瘤细胞IB基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IB基因没有突变。肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB的突变率都增加EnVision两步法点突变或分子量很小的碱基序列突变1 Bargou R.第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为125 L。EnVision两步法DAKO EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。