酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用课件.ppt
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- 关 键 词:
- 免疫 分析 技术 生物 药物 中的 应用 课件
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1、第四节第四节 酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用其应用主要包括以下几个方面:?药物含量(活性)测定?宿主蛋白残留检测?抗生素残留检测?杂质检测?污染物检测?药物原材料检测?药物掺假检测1一、一、GLP-1 活性检测活性检测Cyclic Adenosine Monophosphate(cAMP)ELISA Kit 2GLP-1GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素,它通过与GLP-1受体(GLP-1R)结合发挥作用1)GLP-1可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空来降低血糖2)GLP-1还有减缓细胞凋亡,促进其再生的独特作用3)GL
2、P-1还能减慢胃排空速度,通过作用下丘脑,抑制食欲。3?GLP-1GLP-1结合GLP-1RGLP-1R后,激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路?胰岛成熟胰岛成熟细胞的细胞的GLP-1受体偶联Gs,活化腺苷酰环化酶,产生生cAMP,后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌,刺激胰岛素基因转录和胰岛素原生物合成,可降低胰高血糖素浓度并抑制胰高血糖素分泌,增强细胞对胰岛素的敏感性,刺激胰岛素依赖性糖原合成,降低餐后血糖浓度。4PKACa2+NFAT-PNFATCalcineurin报告基因检测原理5试验原理?采用直接竞争ELISA方法,在酶标板微孔条上预包被cAMP特异
3、性抗体,样品中cAMP将和标准HRP-cAMP竞争结合微孔条上cAMP特异性抗体,用TMB底物显色,吸光值与样品中cAMP的含量成负相关。?以吸光值为纵坐标,样品浓度为横坐标,按四参数法回归以吸光值为纵坐标,样品浓度为横坐标,按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线,得出半效量浓度,求得供试品相对生物活性。6操作程序:1、取微孔板条,加入cAMP特异性抗体,50ul/孔,室温1 h;2、洗涤后,向不同孔中分别cAMP、对照或细胞裂解上清品(样品),100ul/孔;3、向孔中加入HRP-cAMP,50 ul/孔,室温作用2h;4、洗涤后,向孔中加入TMB溶液,200 ul/孔,室温作用30mi
4、n;5、向孔中加入终止液,100 ul/孔,测定OD450nm/570nm7数据与结果1.标准曲线的绘制:(1)测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值,并分别计算平均值;(2)以吸光值为纵坐标,样品浓度为横坐标,按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线,得出半效量浓度;对照品EC50;测试样EC502.数据处理:供试品相对生物活性(%)=对照品EC50/供试品EC50?100%其中:对照品和供试品的EC50分别表示对照品和测试样的半效量的浓度。四参数方程中的C值即相当于半效量的浓度(EC50)。8典型的测定结果及回归曲线典型的测定结果及回归曲线x axis0.111010010001
5、00005000150002500035000Graph#1y=(A-D)/(1+(x/C)B)+D:ABCDR2Plot#1(STd:Concentration vs MeanValue)39559.981.07816.0026571.4050.999Plot#2(100%:Concentration vs MeanValue)38463.371.3115.5647742.070.999Plot#3(50%:Concentration vs MeanValue)38642.451.5431.6327942.7390.999Plot#4(150%:Concentration vs MeanVa
6、lue)38171.11.34312.6557056.6770.996910二、宿主蛋白(二、宿主蛋白(HCP)残留检测)残留检测CygnusF550 CHO HCP ELISA Kit11宿主细胞蛋白污染物?CHO宿主蛋白残留?E-coli 宿主蛋白残留?酵母菌宿主蛋白残留?HEK293宿主蛋白残留12?2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱?将2D Gel上的全蛋白转移至膜上,用多克隆抗体孵育后进行Western Blot 化学发光检测,以确认多克隆抗体能够与哪些宿主细胞蛋白结合体能够与哪些宿主细胞蛋白结合?通过Western Blot 检测结果(多抗能检测到的 HCP数量)与2
7、D膜上检测结果(总 HCP数量)的比较,得出用于评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的 Match Rate评估评估HCP 定量用多克隆抗体的特异性定量用多克隆抗体的特异性1314试验原理试验原理?采用双位点酶联免疫检测法,在酶标板微孔条上采用双位点酶联免疫检测法,在酶标板微孔条上预包被抗CHO CHP多抗,免疫反应构成为夹层式多抗,免疫反应构成为夹层式结构:固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后酶标记抗体。反应结束后清洗酶标板去除未结合反应物,添加清洗酶标板去除未结合反应物,添加 TMB底物显色,吸光值与样品中 CHO宿主蛋白的含量成正相宿主蛋白的含量成正相关。15检测步骤:(1)于每个反应
8、孔中,加入100 L抗CHO HCP多抗-HRP;(2)从标准蛋白液、对照和样品中吸取50 L 上清加入到已标记好的反应孔中;180rpm下室温、振荡培养2h;(3)弃去孔内溶液,每孔加350 L 洗涤液,重复洗涤4次;(4)于每个反应孔中,加入100 L TMB 底物溶液,于室温孵育30min;(5)于每个反应孔中,加入100 L终止液;依序读取OD450/650 nm吸收值(空白对照孔调零)。(6)数据处理:根据测定每孔标准液吸光值绘制四参数逻辑曲线,然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。161718192021ELISA 法研究药物作用靶点(GPb/a受体)?实验原理?根据ELISA
9、实验原理,先在96孔板上包被纤维蛋白原,然后同时加入GPIIb/IIIa受体和待测样品,再加酶标抗体与GPIIb/IIIa受体结合,最后加入底物,酶作用于底物显色,在405nm测得OD值,OD值与GPIIb/IIIa受体量成正比。如果样品与GPIIb/IIIa 受体结合,就会降低纤维蛋白原与受体的结合,导致所测的OD值降低。22?实验步骤:?首先将纤维蛋白原(10 g/ml)用buffer A(0.1 M Na2CO3,PH 9.5)包被于96孔板上(100 l/well)(空白对照:不包被纤维蛋白原),4C孵育过夜;?TACTS(0.02M Tris-HCl,PH 7.5,0.15M NaC
10、l,1mM CaCl2,0.02%NaN3,0.05%Tween 20)冲洗一次,每孔200l,3min;用含1%BSA 的TACTS 在37C封闭1h(200 l/well),TACTS洗三次;?整合素IIb3(20 g/ml、50 L/well)加一定浓度的待测样品50 l作为样品组;加孵育液做阴性对照组;37C下孵育2h;?TACTS 洗三次;加一抗(鼠抗人CD61抗体,含0.5%BSA,TACTS稀释,1:2000(体积比),100L/孔)37C下孵育1h;23?TACTS 洗三次;加二抗(碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG,含0.5%BSA,TACTS稀释,1:1000,100L/孔),
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