第二章基因工程基因工程酶学基础课件.ppt
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1、第二章兰州大学基因工程基因工程酶学基础 内切酶,即在核酸分子内部制造切内切酶,即在核酸分子内部制造切口的酶口的酶 形成形成5-P 和和3-OH末端末端2 2 性性 质质3 3 功功 能能 自我保护作用自我保护作用细菌的限制和修饰系统(细菌的限制和修饰系统(R/M体系)体系)a a 限制(限制(RestrictionRestriction)限制性内切酶将侵入细菌体内的外限制性内切酶将侵入细菌体内的外源源DNADNA分子进行分解,切成小片段分子进行分解,切成小片段AABBBBBb b 修饰(修饰(ModificationModification)细菌自身的细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化碱基被
2、甲基化酶甲基化修饰保护,不能被自身的限制性内切酶修饰保护,不能被自身的限制性内切酶识别切割识别切割 c c 限制修饰系统分子机理限制修饰系统分子机理 由三个连续基因位点所控制:由三个连续基因位点所控制:hsd R,hsdM,hsd S hsd R-限制性内切酶限制性内切酶:能识别能识别DNA分子分子上的特定位点并将双链上的特定位点并将双链DNA切断切断 hsd M-限制性甲基化酶限制性甲基化酶:催化催化DNA分子分子特定位点上的碱基甲基化反应特定位点上的碱基甲基化反应 hsd S-控制两个系统的表达控制两个系统的表达:协助上述协助上述两种酶识别特殊的作用位点两种酶识别特殊的作用位点 宿主细胞内
3、的甲基化酶将自身宿主细胞内的甲基化酶将自身DNADNA和噬菌和噬菌体体DNADNA实施特异性保护,封闭了自身限制实施特异性保护,封闭了自身限制性酶的识别位点性酶的识别位点 这种限制不完全,总有少数入侵这种限制不完全,总有少数入侵DNADNA会存会存活,得以在宿主细胞内复制,并被宿主活,得以在宿主细胞内复制,并被宿主的甲基化酶修饰,但同时,也丧失了原的甲基化酶修饰,但同时,也丧失了原宿主甲基化酶标记宿主甲基化酶标记d d 意义意义 寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程,广泛存在于原核细菌中。有两方面程,广泛存在于原核细菌中。有两方面作用:作用:保护自身保护自身D
4、NA不受限制不受限制 破坏外源破坏外源DNA,使之迅速降解,使之迅速降解二二 限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名 命名:命名:EcoR(E:属名;:属名;co:种名;:种名;R:酶:酶编码基因所在质粒;编码基因所在质粒;:发现次序:发现次序)三三 限制性内切酶类型限制性内切酶类型 目前鉴定出目前鉴定出3种不同的限制性内切酶种不同的限制性内切酶 I 型限制性内切酶型限制性内切酶 II型限制性内切酶型限制性内切酶 型限制性内切酶型限制性内切酶限制性内切酶的类型及其主要特性限制性内切酶的类型及其主要特性 II II型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性 1970年,由年,由H.O.smi
5、th和和K.W.wilcox 从从流感嗜血菌中分离得到流感嗜血菌中分离得到 如如Hind II(1)识别位点)识别位点 未甲基化修饰的特异靶序列,多数呈中未甲基化修饰的特异靶序列,多数呈中心对称的回文结构,由心对称的回文结构,由4-8个碱基组成,个碱基组成,有些识别位点是连续的,有些则是间断的有些识别位点是连续的,有些则是间断的,如,如GANTCC C-A A-P Pu u-P Py y-T T-G GG G-T T-P Py y-P Pu u-A A-C C5 5 3 3 5 5 3 3(2)切割位点)切割位点EcoRGAATTCCTTAAG5 53 35 53 35 5G GC CT TT
6、 TA AA AA AA AT TT TC CG G3 33 35 5粘粘性性末末端端SmaCCCGGGGGGCCC5 53 33 35 55 5C CC CC CG GG GG GG GG GG GC CC CC C3 33 35 5平平头头末末端端绝大多数绝大多数IIII类酶在其识别位点内切割类酶在其识别位点内切割DNADNA 粘性末端粘性末端(cohensive end)连接便利连接便利 DNA 分子末端标记分子末端标记 平末端补齐平末端补齐一把特殊的剪刀一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现阿尔伯阿尔伯(Arber)(Arber)、史密斯、史密斯(Smith)(Smith)
7、和内森斯和内森斯(Nathans)(Nathans),获,获19781978年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖 同裂酶同裂酶 (isoschizomers)(isoschizomers):来源不同,来源不同,识别的是同样的核苷酸靶序列识别的是同样的核苷酸靶序列 同尾酶同尾酶(isocaudamer)(isocaudamer):来源不同,识别的靶来源不同,识别的靶序列也各不相同序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端但都能产生相同的粘性末端由同尾酶所产生的由同尾酶所产生的DNADNA片段,是能够通过其粘性末端之间的片段,是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的,在基因克隆实验
8、中很有用处互补作用而彼此连接起来的,在基因克隆实验中很有用处 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点,称之为合形成的位点,称之为“杂种位点杂种位点”(hybrid site)。但这类杂种位点的结构,。但这类杂种位点的结构,一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素 1 1、DNADNA的纯度的纯度 2 2、DNADNA的甲基化程度的甲基化程度 3 3、酶切反应的温度酶切反应的温度 4 4、DNADNA的分子结构的分子结构 5 5、核酸限制性内切酶的反应缓冲液核酸限制性
9、内切酶的反应缓冲液DNA的纯度的纯度DNADNA的甲基化程度的甲基化程度 原核生物限制原核生物限制修饰体系,对识别序列中特定核苷酸修饰体系,对识别序列中特定核苷酸的甲基化,会强烈影响酶活性。在基因克隆中使用的的甲基化,会强烈影响酶活性。在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌,在选用酶时应是失去甲基化酶的大肠杆菌,在选用酶时应注意注意:所选用的限制酶对甲基化的敏感性所选用的限制酶对甲基化的敏感性 依依DNADNA的不同来源选择不同的限制酶的不同来源选择不同的限制酶反应温度反应温度 大多数的核酸限制内切酶的标准反应温度大多数的核酸限制内切酶的标准反应温度为为37 ,但也有许多例外,如,但也有许
10、多例外,如SmaI为为25 ,ApaI为为30 ,TaqI为为65 消化反应消化反应温度高于或低于温度高于或低于最适反应温度,最适反应温度,都会影响酶的活性都会影响酶的活性 每每ugDNA 用用1-5U酶切酶切1-2hDNA的分子结构的分子结构 某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒或病毒DNA所需的所需的酶量比消化线性酶量比消化线性DNA高出高出20倍倍 一些核酸内切酶,切割处于不同位置的限制位点,其效率有一些核酸内切酶,切割处于不同位置的限制位点,其效率有明显的差异,明显的差异,可能是由于可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差异侧翼序列的核苷酸成分的差异造造成
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